鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。

套式聚合酶链式反应在疟原虫检测和分型中的应用研究

目的比较疟疾病例样本套式PCR检测和传统镜检结果,探讨套式PCR在疟疾诊断中的应用价值。方法采集疟疾患者血样,分别涂制厚、薄血膜用于常规镜检;抗凝血或滤纸血用于提取疟原虫DNA等。按要求设计属种等多套引物,应用套式PCR扩增感染人的4种疟原虫目的基因片段,将检测结果与镜检结果进行比较分析,并对目的片段进行测序鉴定等。结果 259份血样,套式PCR共检测出恶性疟187例、间日疟45例、卵形疟8例和三日疟1例,阴性10例。其中恶性疟阳性检出率最高(75.10%),间日疟阳性检出率次之(18.07%),还检测到混合感染血样8份(3.21%)。与Gen Bank标准序列对比显示,扩增片段大小及测序结果均完全正确,显示套式PCR在分型上比传统镜检更客观。套式PCR检测与传统镜检结果比较显示,前者阳性率(96.14%)明显高于后者(90.73%),并且差异具有统计学意义(χ2=12.07,P<0.05)。结论套式PCR法检测疟原虫具有较高敏感性和特异性,且适用于疟原虫混合感染,在疟疾病例诊断和分型方面均具有良好的应用前景。

套式聚合酶链式反应诊断三日疟原虫感染的临床应用

目的应用套式聚合酶链式反应(PCR)扩增小亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)基因诊断三日疟原虫感染,以减少三日疟的漏诊和误诊。方法分别提取可疑三日疟患者抗凝血DNA和对照间日疟、恶性疟患者抗凝血DNA,以此为模板,用疟原虫属特异性引物进行第一轮扩增;然后以第一轮扩增产物为模板,用4种疟疾的种特异性引物进行第二轮扩增,比较扩增出的18 SSU rRNA基因片段的大小,并对目的片段进行测序鉴定。结果经属特异性引物PCR扩增后,3个样本均出现大小约为1 200bp的条带。经种特异性引物PCR扩增后,间日疟及恶性疟确诊样本均扩增出相应的120bp和205bp特异性条带;可疑患者样本仅在用三日疟原虫种特异性作引物时扩增出144bp特异条带,与理论值相符,与Genbank标准序列对比显示,扩增片段大小及测序结果均完全正确。证实患者感染三日疟原虫。结论利用小亚单位核糖体核糖核酸基因片段三日疟种特异引物进行扩增可以用于诊断三日疟原虫感染。

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因3′端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法。筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果。结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠。应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率。

深圳地区男男同性恋人群中HIV-1分子流行病学研究

目的了解深圳地区男男同性恋人群中艾滋病病毒-Ⅰ型(HIV-1)毒株的分子流行情况,帮助分析HIV-1在该人群中传播的危险因素。方法收集深圳市2006年男男同性恋人群中HIV-1确认为阳性的样本18例,应用套式聚合酶链式反应(Nested-PCR)技术,对该样本膜蛋白基因(env基因)和核心蛋白基因(gag基因)进行扩增,并对各基因区核苷酸序列进行测定和分析。结果18份样本中共存在CRF01 AE、CRF07 BC、CRF08 BC 3种重组毒株及B一种亚型,分别占55.56%(10/18)、16.67%(3/18)、5.56%(1/18)和22.22%(4/18);在env基因区与对应的流行代表株01 AE.TH.90.CM240、07 BC.CN.97.97CN001、08 BC.CN.97.97CNGX 9F、B.US.86.JRFL的基因离散率分别为(8.778±1.296)%、(7.650±0.212)%、11.300%和(13.300±0.819)%;CRF01 AE、CRF07 BC重组株和B亚型组内离散率分别为(10.192±4.179)%、(2.000±0.000)%和(14.367±8.812)%;在gag基因区与对应的流行代表株01 AE.TH.90.CM240、07 BC.CN.97.97CN001、08 BC.CN.97.97CNGX 9F、B.FR.83.HXB2的基因离散率分别为(5.070±1.132)%、(2.167±0.551)%、4.800%和(7.350±1.926)%;CRF01 AE、CRF07 BC重组株和B亚型组内离散率分别为(4.504±1.692)%、(0.700±0.346)%和(10.167±4.352)%。结论深圳地区男男同性恋人群HIV-1流行株以CRF01-AE重组亚型为主,其次是B亚型,也存在CRF07 BC和CRF08BC重组亚型。

猪瘟病毒3种检测方法的比较

本研究旨在比较3种检测猪瘟病毒方法的优缺点。应用反转录—复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)、荧光抗体法、胶体金免疫层析试纸条3种方法,分别对30份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒进行检测。试验结果显示,RT-nPCR方法检出阳性样品数为11份,荧光抗体法为13份,胶体金免疫层析试纸条为8份;3种方法检测全为阳性8份,全为阴性17份。试验结果表明,荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果,敏感性比较差;胶体金免疫层析试纸条诊断方法最大的优点就是简便快速,且适合基层的应用,该方法的不足之处就是敏感性较低;RT-nPCR检测法具有快速、敏感等优点,但需一定仪器设备及成熟的技术方法。RT-nPCR还能区分待检样品为疫苗毒株(弱毒)还是野毒株感染(强毒),这是其他2种方法所不可比拟的。

女性性服务者生殖道4种病原体感染状况分析

目的 探讨解脲支原体(Uu)、人型支原体(Mh)、生殖支原体(Mg)、加德纳菌(GV)在女性性服务人群中感染状况。方法 收集女性性服务者和妇科门诊病人生殖道拭子标本,采用套式聚合酶链式反应(nPCR)方法检测,电泳后紫外光下观察结果;采用统一问卷以个体访谈方式收集女性性服务者年龄、婚姻和安全套使用等资料。结果 75名女性性服务者中,Uu、Mh、Mg、GV检出率分别为78.6 7% ,36 .0 0 % ,17 .33% ,36 . 0 0 % ;4 2例门诊病人中Uu、Mh、Mg、GV检出率分别为4 0 . 4 8% ,11. 90 % ,2 1 .4 3% ,19. 0 5 %。2组的Uu、Mh检出率差异有统计学意义(P <0 . 0 1)。女性性服务者中GV与Uu、Mh、Mg合并感染的构成分别为36 . 5 1% ,38. 4 6 % ,11 .11% ,门诊病人中分别为32 % ,8 33% ,0 .0 0 %。女性性服务人群年龄、婚姻状况、安全套使用等因素与Uu、Mh、Mg、GV检出率的相关性分析无统计学意义。结论 女性性服务者的Uu、Mh、Mg、GV检出率较高,GV分别与Uu、Mh、Mg等合并感染也相对较高,应加强女性性服务者Uu、Mh、Mg、GV的监测和防治。

猪瘟疫苗毒株和流行毒株RT-nPCR检测方法的建立

为给临床快速鉴别诊断猪瘟提供技术依据,根据GenBank公布的CSFV全基因序列,结合猪瘟序列测定结果,针对NS5B基因区域设计2条通用外扩引物、2条通用内扩引物和1条疫苗毒株特异性内扩引物,建立一种可鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株的RT-nPCR诊断方法。结果显示,该方法可从HCLV株扩增出2条大小分别为261bp和157bp的片段,可从Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002等流行毒株扩增出1条261bp的片段,其他几种常见猪病毒检测均呈阴性;灵敏度试验表明,检测的cDNA质量浓度极限为3.4×10-7 pg/L;116份临床样品中有37份样品检测呈阳性,阳性率为32%;分析部分阳性病料E2基因序列也证实检测结果的准确性。说明:建立的RT-nPCR鉴别诊断方法灵敏度高、特异性好,能直观区分猪瘟疫苗毒株和流行毒株。

北京市一例HIV-1 CRF15_01B亚型类似毒株的鉴定

目的通过对一例HIV-1毒株env、gag和pol基因的序列分析,表明HIV-1 CRF15_01B亚型类似毒株已在北京市出现。方法从一例在北京居住的四川籍女性HIV-1感染者(BJ06108,通过性途径感染)血浆中提取病毒RNA,使用套式PCR方法扩增env、gag和pol基因,并进行序列测定和亚型分析。结果病例BJ06108在env、gag和pol基因区与CRF15_01B亚型参考株1501B.TH.99.99TH_MU2079基因离散率较近,基因离散率分别为8.8%、6.1%和7.2%。系统进化树分析表明BJ06108与CRF15_01B亚型参考株1501B.TH.99.99TH_MU2079聚在一起。结论CRF15_10B亚型类似毒株已在北京市出现,应该加强HIV-1毒株亚型变异的监测。

广西牛群戊型肝炎病毒感染情况调查

为了解广西牛群中戊型肝炎(HE)的感染状况,应用反转录—套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)对采自广西8个市牛群的粪、肝样品进行了戊型肝炎病毒(HEV)RNA检测。结果从广西6个市牛粪样品中检出HEV阳性率为19.13%(35/183),从4个市牛肝样品中检出HEV的阳性率为20%(5/25),8个市牛粪、牛肝样品中HEV的总阳性率为19.23%(40/208)。表明广西受检牛群中存在HEV感染,应重视牛HE这一新发人畜共患传染病的防控。

禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白S_1基因的RFLP与序列比较分析

利用反转录一套式聚合酶链式反应技术从北京地区禽传染性支气管炎病毒(IBV)分离株 BJ_1、BJ_2、BJ_3株中成功扩增出1054bp 纤突蛋白高变区。利用限制性内切酶 Sin Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切分析证实了RT-nested PCR 的特异性,结合计算机酶切位点分析图谱进行理论 RFLP 分析。将三段 S_1基因分别克隆到pUC19质粒中,获得重组质粒 pUC IBV S_1-BJ_1、pUC IBV S_1-BJ_2、pUC IBV S_1-BJ_3。利用双脱氧链终止法对三个重组质粒进行双向测序,获得三株分离株 S_1基因高变区的序列。将得到的三个序列与标准株 M_(41),Beaudette 株和疫苗株 H_(120)及广东地方分离株 D_(41)株进行核酸序列同源性比较分析。结果表明,三株分离株核酸碱基序列和氨基酸序列与 M_(41)株的同源性比与 H_(120)株和 Beandette 株的同源性高。本研究对于进一步深入探讨禽传染性支气管炎病毒(IBV)分子变异机制研究奠定了良好的基础。

套式逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA的临床应用

目的评价套式逆转录PCR检测血清戊肝病毒(HEV)RNA的临床意义。方法对GenBank数据库中的戊型肝炎病毒全基因组序列进行分析比对,并针对国内流行的HEV株序列,选择位于ORF2的保守区域设计引物,建立套式逆转录聚合酶链式反应(nRT-PCR)方法,并检测126例急性戊型肝炎患者,并与检测抗-HEV IgM的方法进行比较。结果 126例急性戊型肝炎患者血清中有67例HEV-RNA阳性,对照组血清HEV-RNA检测均为阴性;与血清抗-HEV IgM检测结果比较,HEV-RNA检测的总符合率为80.91%,两种方法的检测结果具有良好的一致性;nRT-PCR方法检测HEV-RNA与血清抗-HEV IgM检测方法存在明显的差异,不能相互替代,而有一定的互补性;3例患者的首份血清检测为HEV-RNA阳性,但抗-HEV IgM为阴性,系列追踪检测,均相继出现抗-HEV IgM,急性戊型肝炎患者血清HEV-RNA的检出多在发病的1～12d。结论应用nRT-PCR方法能对急性散发戊型肝炎患者血清中的HEV RNA进行定性检测,且有较高的特异性和敏感性,临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平,具有一定的临床应用价值。

家畜戊型肝炎病毒诊断方法的建立及应用

目的建立检测家畜戊型肝炎病毒(HEV)反转录套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法,并应用于广西地区家畜戊型肝炎感染调查。方法参考GenBank上4种基因型HEV核苷酸序列,应用生物软件Oligo6.0在ORF2保守区设计两对简并引物,扩增目的片段为436bp,进行了特异性、敏感性和重复性试验,并对采自广西地区猪、牛和羊的肝粪样本进行HEV检测。结果检测家畜粪便样本阳性率31.49%(285/905);家畜肝脏样本阳性率18.01%(49/272)。结论所建立的RT-nPCR方法适用于家畜肝粪样本HEV检测,临床检测应用表明广西家畜存在HEV感染。

宫颈糜烂与衣原体、支原体感染的关系及其临床意义

对 194例宫颈糜烂 (分轻、中、重 3组 )患者及 30例无宫颈糜烂的正常组 ,检测其宫颈分泌物和血中的沙眼衣原体 (CT)、解脲支原体 (UU)。结果 :宫颈糜烂中、重度组CT及UU阳性检出率宫颈分泌物中分别为 48.10 %、6 7.44 %和 39.2 4%、5 8.81% ,血中分别为 5 1.89%、5 3.49%和 40 .5 1%、46 .5 1% ;CT、UU双重阳性率宫颈分泌物中分别为 34 .18%和 46 .5 1% ,血中分别为 31.6 5 %和 41.86 % ;宫颈分泌物和血中CT均阳性分别为 41.77%和39.5 3% ,UU均阳性分别为 30 .38%和 2 5 .5 8% ,均明显高于正常组和轻度糜烂组 (分别P <0 .0 5和P <0 .0 1)。提示宫颈糜烂与CT、UU感染相关 ,其阳性检出率与宫颈糜烂程度密切相关。

河南省牛病毒性腹泻病毒分子流行病学调查与分析

为了解河南地区规模化奶牛场牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的感染情况及主要基因型,用商品化酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对来自河南省14个市和不同地区的40个规模化奶牛养殖场共5 486份血清中BVDV抗原进行检测,同时对ELISA方法检测的97份抗原阳性样本,用套式逆转录-聚合酶链式反应(nRT-PCR)进行BVDV抗原检测和基因分型。结果表明,A10奶牛场BVDV抗原阳性率最高,为7.8%(11/141),A11、A17奶牛场BVDV抗原阳性率最低,为0.66%(1/151)。不同牛场的BVDV抗原阳性率为0~7.8%,平均阳性率为1.77%;河南地区牛病毒性腹泻病毒的基因型均为BVDV-1型,未发现其他基因型。提示BVDV在河南省规模化奶牛场存在,但不同地区、不同牛场的BVDV阳性率不同,主要以BVDV-1型感染为主。

北京市2007年新确认HIV-1感染者流行毒株gag基因序列测定和亚型分析

为了解北京市HIV-1亚型特点和流行特征,随机采集北京市2007年新确证HIV-1感染者的抗凝全血标本200份,分离血浆,提取病毒RNA,用套式聚合酶链式反应扩增病毒gag基因,并进行序列测定和亚型分析。系统进化分析确定北京市HIV-1流行毒株分别属于7个亚型和流行重组型,分别为A1亚型1份,B亚型35份,泰国B亚型19份,C亚型3份,CRF01_AE亚型49份,CRF07_BC亚型51份,CRF08_BC亚型3份。北京市己存在7种HIV-1亚型和流行重组型,应该加强北京市HIV-1亚型流行情况的监测。