两个奥利亚罗非鱼品系对无乳链球菌的耐受性研究

为探讨两个奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)品系对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的耐受性,研究以奥利亚罗非鱼埃及品系(AE品系)和“夏奥1号”(AX品系)为研究对象,人工腹腔注射无乳链球菌,并在感染后0、7h、24h、48h、72h、120h和168h采集罗非鱼血液和脾脏,比较感染后7d存活率差异,研究血清生化指标和脾脏促炎性细胞因子表达变化。结果显示,人工感染后AE奥利亚罗非鱼存活率显著高于AX奥利亚罗非鱼。感染后两种奥利亚罗非鱼血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、球蛋白(GLO)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和溶菌酶(LZM)含量在感染后都显著升高;甘油三酯(TG)和白蛋白/球蛋白(A/G)显著下降,呼吸暴发受抑制;且AE品系的血清GLO和SOD水平在感染后期显著高于AX品系。定量PCR结果显示两种奥利亚罗非鱼脾脏TNF-α、IL-1β和IL-6表达在感染后7h都显著升高,但AE品系在感染后期3种促炎性细胞因子的表达都显著低于AX品系。研究表明,AE品系对无乳链球菌的抗病力强于AX品系,在感染后期的抗氧化能力更强,炎症程度更轻,从而保持对无乳链球菌更大的耐受性。研究结果为培育抗链球菌病的奥尼罗非鱼提供抗性的亲本种质资源。

不同盐度对奥利亚罗非鱼幼鱼鳃、肾和肝组织结构的影响

为探究不同盐度对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)幼鱼的鳃、肾和肝脏组织结构变化的影响,本研究以奥利亚罗非鱼幼鱼为研究对象,设置0‰、3‰、5‰、7‰、9‰和11‰等6个盐度梯度组,进行为期60 d的养殖。通过组织学比较分析不同盐度条件下幼鱼的鳃、肾和肝脏组织结构变化特征。结果显示:0‰组幼鱼鳃丝结构完整,泌氯细胞较少,鳃小片细长。随着盐度的升高,各组鳃丝间隔差异不明显,但鳃丝细胞出现萎缩,泌氯细胞增多,鳃小片变短,其中11‰组最短,与0‰差异显著;鳃小片宽度随着盐度的增加表现为先升后降趋势,7‰组宽度最大,并与0‰组差异显著,而且11‰组鳃丝出现不同程度的组织分离和细胞脱落现象。0‰组幼鱼的肾小球发达,大多数较为饱满。随着盐度增加,肾小管和肾小球逐渐萎缩,肾小囊的囊腔变大。0‰组幼鱼肝细胞界限明显,细胞核清晰,肝细胞结构比较完整。从3‰组开始幼鱼的肝血窦丰富,肝细胞出现少量空泡现象,但细胞核和细胞界限仍较为明显。5‰~11‰组随着盐度增加幼鱼的肝细胞空泡化、核偏移逐渐严重,并且血管和肝血窦数量相对于对照组有所提高。综上,长期盐度养殖奥利亚罗非鱼建议将盐度水平控制在5‰内较为合适。

POU1F1基因SNP位点与尼罗罗非鱼体质量和形态性状的相关性

【目的】研究POU1F1基因的单核苷酸多态性(SNP),评估多态性与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的体质量和形态性状的相关性,为罗非鱼以生长性状为目的的选育提供参考。【方法】利用PCR产物测序方法,从POU1F1中共筛查到28个多态性较高的位点,分析尼罗罗非鱼高要亲代群体的这些位点与其体质量及全长、体长、头长、体高、体宽等6个形态性状的相关性,并在尼罗罗非鱼高要子代群体和番禺群体中验证,将获得的体质量和形态相关位点进一步在尼罗罗非鱼海南群体中验证。【结果与结论】高要亲代群体和子代群体中,分别有6个位点[S3(A-400G)、S4(A-469T)、S5(I-539D)、S6(A-881G)、S7(A-888G)和S12(C-1365T)]和5个位点[S3、S5、S11(I-1358D)、S13(C-1511T)、S14(A-1539T)]与体质量、形态性状相关。POU1F1基因11个SNP位点中,未发现与番禺群体体质量和形态性状相关联的位点。POU1F1基因6个SNP位点与海南雌雄群体关联分析表明,S4位点与海南雌性群体体质量相关,S3和S5位点与雄性群体体质量相关。双倍型与各群体体质量、各形态性状关联分析表明,在高要亲代群体中获得体宽相关双倍型2个;在高要子代群体、番禺群体及海南雄性群体中未获得与生长性状相关双倍型;在海南雌性群体中获得与体质量相关的双倍型1个。

尼奥鱼[尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)]同其亲本的形态和判别

本文报道尼奥鱼同其亲本尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼形态上的异同点和判别方法。用卡方法对８ 个可数形态参数，用聚类分析和判别分析及主成分分析的方法对８ 个可量性状和２４个框架参数进行综合分析。从体色上看，尼奥鱼偏于父本奥利亚罗非鱼，而三种多元分析的结果均表明尼奥鱼的体型偏于母本尼罗罗非鱼， 因此认为控制体色和体型遗传的是不同的基因组合。建立了区分尼罗、奥利亚和尼奥鱼的简单判别公式。

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼核型及DNA含量的比较研究

采用ＰＨＡ体内培养法，取鱼体肾细胞用空气干燥法制备奥利亚罗非鱼（Ｓａｒｏｔｈｅｒｏｄｏｎａｕｒｅａ）和尼罗罗非鱼（Ｓ．ｎｉｌｏｔｉｃａ）的染色体，经核型分析，奥利亚罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。尼罗罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。经流式细胞仪测量外周血红血球的ＤＮＡ含量，奥利亚罗非鱼为２Ｃ＝２．２２ｐｇ（２．２２ｐｇ／Ｎｕｃｌ．）；尼罗罗非鱼为２Ｃ＝２．２７ｐｇ（２．２７ｐｇ／Ｎｕｃｌ．）。经对比分析，两种鱼的核型和ＤＮＡ含量之间的差异不显著，在分类地位上非常接近。

杂交一代(尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂)及其亲本基因组DNA的比较

采用RAPD技术 ,用 2 0个随机引物对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交一代的精巢DNA进行扩增反应 ,发现引物OPZ - 14和OPZ - 18在尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼之间扩增出有差异的DNA片段 ,作为鉴定两种鱼的分子标记有较高可信度。对这两种鱼的杂交一代基因组DNA的RAPD扩增能获得足够的多态性 ,2 0个引物中有 8个引物扩增出差异性产物 ,表明杂交一代基因杂合性增强 ,这是杂种优势得以形成的重要遗传物质基础之一。

奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)MyoD1和MyoD2基因全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090bp,包括5′非翻译区(UTR)137bp,3′UTR50bp,开放阅读框(ORF)903bp,编码300个氨基酸,其中第110～161个氨基酸为bHLH结构,第233～249个氨基酸为helixIII结构;MyoD2全长均为1478bp,包括5′UTR215bp,3′UTR471bp,ORF792bp,编码263个氨基酸,其中第91～142个氨基酸为bHLH结构,第212～228个氨基酸为helixIII结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%～92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%～79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支,MyoD1所反映的不同鱼类间的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼[Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus(♀)]进行鉴定。结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。该研究为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。

尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼性腺的RAPD分析

By using RAPD technique,testes genomic DNA from T.aurea and T.nilotica were analysed.With 20 primers,249 fragments were attained, and the similarity percentage between two species of fish is 89.96%. Species specific fragments were produced respectively by primers OPZ 14 and OPZ 18 between two species of fish.It is suggested that these fragments may be used as molecular markers in fish′s species

奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼rDNA内转录间隔区序列特征

核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)是经常被用作种和种群水平系统研究的分子序列。本文分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)内转录间隔区,包括部分18S序列,ITS1、5.8S、ITS2全序列及部分28S序列。4尾奥利亚罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其存在长度不同的a、b两种类型ITS1。a型长为536 bp,GC含量为69.96%;b型长为520 bp,GC含量为69.04%～69.42%。4尾尼罗罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其只存在a型ITS1,长为536～540 bp,GC含量为69.42%～70.19%。与b型ITS1相比,a型ITS1在16～31 nt有16 bp片段(GGCCCGCCTGCGGCGC)的插入。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼共20条ITS序列中,5.8S长度均为157 bp,GC含量为56.69%～57.96%;ITS2为408 bp,GC含量为72.79%～74.26%。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼ITS区序列相似性高达98.2%,表明这两种罗非鱼亲缘关系很近。此外,本文对14尾奥利亚罗非鱼、15尾尼罗罗非鱼以及15尾奥尼罗非鱼[O.aureus(♂)×O.niloticus(♀)]ITS1的扩增结果显示,奥利亚罗非鱼均有a、b两种类型ITS1;15尾尼罗罗非鱼中1尾为a、b两类型ITS1,14尾为a型ITS1;15尾奥尼罗非鱼中则有6尾具有a、b两类型ITS1,9尾为单一的a型ITS1。分析表明,奥利亚罗非鱼在ITS1这个位点一致性高,但尼罗罗非鱼中有1尾混杂了奥利亚罗非鱼的基因,同时也说明分子生物学手段应用于种质鉴定比形态学手段更为精确。

我国尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼养殖群体的遗传渐渗

用ＬＫＢ平板电泳仪、４．４％聚丙烯酰胺凝胶对南京罗非鱼良种场尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼养殖群体肌、肝、脑、心、眼中的１０种同工酶进行电泳分析的结果表明，奥利亚罗非鱼的群体未见多态位点，平均杂合度为０，是超“纯”的养殖群体；尼罗罗非鱼群体中有２０％的尼奥杂交鱼，其体形酷似尼罗，难以肉眼鉴别。由此可见，我国尼罗罗非鱼养殖群体中已存在遗传渐渗问题，须注意防杂和提纯。在剔除了杂交鱼后，该场尼罗罗非鱼群体的平均杂合度为０．０４０，ＥＳＴ有多态现象。

不同组合尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)养殖性能差异研究

用三个尼罗罗非鱼品系和同一种奥利亚罗非鱼生产了三个杂交组合，对他们的雄性率、生长率、成活率及单位面积净产量的比较试验表明：①雄性率为“泰国”（♀）×奥利亚（♂）＞“吉富”（♀）×奥利亚（♂）＞“88”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01）；②绝对增重率为“吉富”（♀）×奥利亚（♂）和“泰国”（♀）×奥利亚（♂）＞“88”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01），瞬时增重率为“吉富”（♀）×奥利亚（♂）和“88”（♀）×奥利亚（♂）＞“泰国”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01）；③成活率为吉富（♀）×奥利亚（♂）和“88”（♀）×奥利亚（♂）＞“泰国”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01）；④单位面积净产量为“吉它”（♀）×奥利亚（♀）＞“泰国”（♀）×奥利亚（♂）＞“88”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01）。总的说来，养殖性能以“吉富”（♀）×奥利亚（♂）较好，“泰国”（♀）×奥利亚（♂）次之，“88”（♀）×奥利亚（♂）较差。

不同群体尼罗罗非鱼×奥利亚罗非鱼组合的杂交效果比较

为评估不同群体尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,♀)×奥利亚罗非鱼(O.aureus,♂)组合的杂交效果,分别选择了尼罗罗非鱼新吉富、苏丹群体和奥利亚罗非鱼茂名、以色列群体为亲本,在小土池中开展二元组合杂交试验,并以新吉富群体自繁作为对照组,统计各杂交组合出苗量和后代雄性率差异。结果表明,尼罗罗非鱼种内配组的出苗量显著高于尼奥杂交组合,杂交组合内以新吉富♀×以色列♂组合的尾日均出苗量最高;尼奥杂交组合后代的雄性率显著高于尼罗罗非鱼种内配组,杂交组合内以新吉富♀×茂名♂组合杂交后代的雄性率最高。

不同尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼亲本群体的遗传特征分析

从86对尼罗罗非鱼遗传图谱标记中筛出17对种间差异性微卫星引物,分别对杂交亲本尼罗罗非鱼苏丹群体、新吉富群体,奥利亚罗非鱼以色列群体、茂名群体的遗传特征进行分析。结果表明,4个罗非鱼群体有效等位基因数:新吉富(2.8)>苏丹(2.72),以色列(2.96)>茂名(2.6);遗传杂合度:苏丹(0.73)>新吉富(0.68),以色列(0.89)>茂名(0.56);多态性含量:苏丹(0.58)>新吉富(0.51),以色列(0.56)>茂名(0.52),尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼分别以新吉富、茂名群体遗传多样性较低。尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼群体间平均遗传距离为0.3057,尼罗罗非鱼苏丹群体与新吉富群体间的遗传距离为0.107,奥利亚罗非鱼以色列群体与茂名群体间的遗传距离为0.1268,尼罗罗非鱼苏丹群体与奥利亚罗非鱼茂名群体间的遗传距离最大。

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽S-转移酶基因克隆与分析

通过RT-PCR法和RACE法,分别从奥利亚罗非鱼(Oreochromisco aureus)肝脏获得alpha、rho1、rho2型GST(GSTA、GSTR1、GSTR2)基因cDNA全序列,从尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏获得GSTR1、GSTR2基因cDNA全序列。结果表明:奥利亚罗非鱼GSTA基因cDNA全序列为933bp,5′非翻译区(5′-UTR)为98bp,3′非翻译区(3′-UTR)为166bp,开放阅读框(ORF)为669bp,编码222个氨基酸。奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR1基因ORF均为681bp、均编码226个氨基酸;奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR2基因ORF均为693bp,均编码230个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明,罗非鱼GST基因与鱼类GST同源性较高,与哺乳类、鸟类、两栖类GST同源性较低。

尼罗与奥利亚罗非鱼对池塘蓝藻水华及水质影响的研究

利用尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼进行了池塘抑藻试验,采用血球计数板测定水体中的微囊藻密度,并对水体理化性质进行了检测分析。试验结果表明,罗非鱼能有效消减水体中蓝藻生物量,降低水体藻毒素浓度,并对水体TN、TP产生一定影响。其中奥利亚罗非鱼试验组蓝藻初始密度为1.53×108cells/L,下降至0.86×108cells/L,降低43.79%;尼罗罗非鱼组蓝藻初始密度为1.54×108cells/L,下降至0.51×108cells/L,降低66.88%。水体总磷含量无显著变化,总氮含量有所下降,水体微囊藻毒素MC-LR含量随着蓝藻密度的下降而降低,并讨论了尼罗与奥利亚罗非鱼摄食抑制蓝藻的摄食抑制及其对水质的影响。

尼罗罗非鱼(♀)、奥利亚罗非鱼(♂)及其杂种(F_1)酯酶(EST)同工酶的研究

用聚丙烯酰胺凝胶平板电泳方法研究两种罗非鱼及其杂种 F_1的血清、肝脏、肌肉组织的 EST 同工酶表明:两种罗非鱼各自有其特定的酶谱;杂种 F_1的酶谱中出现了双亲所没有的“新杂种酶带”和双亲的“互补酶带”。

尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼及其杂种一代的雄性率,生长对比的初步观察

为了谋求罗非鱼的高产优质，探索罗非鱼单性养殖的途径，巳成为当今举世瞩目的课题。我们于1985年在慈利县罗非鱼繁殖场进行了尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂种(正反交)一代的雄性率、个体生长速度、群体生产力比较的初步观察。现将试验结果报告如下：

尼罗罗非鱼claudin-5基因克隆及其在无乳链球菌胁迫下的表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)紧密连接蛋白5(claudin-5)基因,分析其在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)刺激下的表达模式,为进一步了解该基因功能提供依据。【方法】根据NCBI已公布的尼罗罗非鱼基因组预测序列(GenBank登录号:XM_005473513.4),选取其claudin-5基因的CDS区,设计claudin-5基因的克隆及实时荧光定量PCR引物。利用生物信息学对克隆得到的claudin-5进行理化性质和进化分析,采用qRT-PCR分析尼罗罗非鱼claudin-5在各组织中及无乳链球菌刺激下的表达模式。【结果】通过PCR克隆技术获得尼罗罗非鱼claudin-5基因全长序列,共651 bp,编码216个氨基酸;蛋白分子量约23 kD,理论等电点(pI)为8.53;具有4个跨膜结构域和3个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点。尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼(O.aurea)的claudin-5氨基酸序列相似性高达97.55%;系统发育进化树结果也显示,二者claudin-5氨基酸序列聚为一支,表明二者具有较近的亲缘关系。尼罗罗非鱼claudin-5在脑部的表达量极高,是血细胞等组织的300倍左右,具有明显的组织特异性。经无乳链球菌刺激后,尼罗罗非鱼脑和头肾的claudin-5表达量在12 h时达到最高值,在24 h时有所下调,其中在脑部的表达量于48 h表达量最低,但仍高于0 h,而在头肾的表达量在48~96 h时出现明显上调后下降;肠中claudin-5表达量在无乳链球菌刺激后6~12 h时上升缓慢,在48 h时表达量大幅度上调,并达到最高值,之后在48~96 h时出现下调,但低于0 h;肝脏中claudin-5表达量在无乳链球菌刺激后出现明显下调,在24 h略有回升然后继续下调。【结论】尼罗罗非鱼claudin-5基因在脑组织的表达量极高,具有明显的组织特异性,其编码蛋白在宿主抵抗无乳链球菌入侵的过程中发挥重要作用,尤其是通过血脑屏障抵抗无乳链球菌,保护中枢神经系统。

五品系尼罗罗非鱼对自然慢性低温胁迫的生理响应

为筛选出耐低温性能较好的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)品系,本研究以尼罗罗非鱼埃及品系(NE品系)、埃及尼罗抗逆品系(NER品系)、湘湖品系(NX品系)、新吉富(NNG品系)和吉富品系(NG品系)为研究对象,采用从最适生长温度28℃自然降温到死亡临界温度11℃的方法,分别测定它们在两个温度条件下血液生化和酶类指标的变化;当水温降到11℃后,连续观察一周,统计每种尼罗罗非鱼的存活率,绘制Kaplan-Meier曲线,比较5个品系尼罗罗非鱼的耐寒性能差异。结果显示,NER品系的存活率最高;NX品系和NER品系葡萄糖水平极显著升高,NER品系和NG品系总蛋白水平极显著降低,而白蛋白/球蛋白的值均没有显著性变化;超氧化物歧化酶、溶菌酶及乳酸脱氢酶活性均显著或极显著升高,但NER品系的乳酸脱氢酶活性升高程度最低;同时NX品系、NG品系、NE品系和NG品系的丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶水平均极显著增高,但NER品系的丙氨酸氨基转移酶水平没有显著性变化,其天门冬氨酸氨基转移酶水平只是显著增高。上述结果表明5个品系尼罗罗非鱼能一定程度抵御低温对机体带来的损伤,适应慢性自然降温,但NER品系存活率最高,肝功能和肌肉受损程度相对最小,在5个品系尼罗罗非鱼中耐寒性能最强。