两个奥利亚罗非鱼品系对无乳链球菌的耐受性研究

为探讨两个奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)品系对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的耐受性,研究以奥利亚罗非鱼埃及品系(AE品系)和“夏奥1号”(AX品系)为研究对象,人工腹腔注射无乳链球菌,并在感染后0、7h、24h、48h、72h、120h和168h采集罗非鱼血液和脾脏,比较感染后7d存活率差异,研究血清生化指标和脾脏促炎性细胞因子表达变化。结果显示,人工感染后AE奥利亚罗非鱼存活率显著高于AX奥利亚罗非鱼。感染后两种奥利亚罗非鱼血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、球蛋白(GLO)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和溶菌酶(LZM)含量在感染后都显著升高;甘油三酯(TG)和白蛋白/球蛋白(A/G)显著下降,呼吸暴发受抑制;且AE品系的血清GLO和SOD水平在感染后期显著高于AX品系。定量PCR结果显示两种奥利亚罗非鱼脾脏TNF-α、IL-1β和IL-6表达在感染后7h都显著升高,但AE品系在感染后期3种促炎性细胞因子的表达都显著低于AX品系。研究表明,AE品系对无乳链球菌的抗病力强于AX品系,在感染后期的抗氧化能力更强,炎症程度更轻,从而保持对无乳链球菌更大的耐受性。研究结果为培育抗链球菌病的奥尼罗非鱼提供抗性的亲本种质资源。

尼奥鱼[尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)]同其亲本的形态和判别

本文报道尼奥鱼同其亲本尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼形态上的异同点和判别方法。用卡方法对８ 个可数形态参数，用聚类分析和判别分析及主成分分析的方法对８ 个可量性状和２４个框架参数进行综合分析。从体色上看，尼奥鱼偏于父本奥利亚罗非鱼，而三种多元分析的结果均表明尼奥鱼的体型偏于母本尼罗罗非鱼， 因此认为控制体色和体型遗传的是不同的基因组合。建立了区分尼罗、奥利亚和尼奥鱼的简单判别公式。

不同群体尼罗罗非鱼×奥利亚罗非鱼组合的杂交效果比较

为评估不同群体尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,♀)×奥利亚罗非鱼(O.aureus,♂)组合的杂交效果,分别选择了尼罗罗非鱼新吉富、苏丹群体和奥利亚罗非鱼茂名、以色列群体为亲本,在小土池中开展二元组合杂交试验,并以新吉富群体自繁作为对照组,统计各杂交组合出苗量和后代雄性率差异。结果表明,尼罗罗非鱼种内配组的出苗量显著高于尼奥杂交组合,杂交组合内以新吉富♀×以色列♂组合的尾日均出苗量最高;尼奥杂交组合后代的雄性率显著高于尼罗罗非鱼种内配组,杂交组合内以新吉富♀×茂名♂组合杂交后代的雄性率最高。

奥利亚罗非鱼(♀)×鳜(♂)杂交后代的形态

通过测定美国奥利亚罗非鱼(Ao)、Ao(♀)×鳜(♂)的子代(As1)、埃及奥利亚罗非鱼(Eo)、Eo(♀)×鳜(♂)的子代(Es1)、As1(♀)×Ao(♂)的所谓"回交"子代(As2)、Es1的兄妹交子代(Es2)的形态和框架数据,用卡方分析、聚类分析、判别分析,比较了它们之间的形态异同。可数性状卡方分析表明,这几组实验鱼可数性状无显著差异;形态和框架数据的聚类分析结果表明,除了As2与Ao之间无显著差异外,其它都有显著差异,其中As1和Es1与其它鱼的差异最大,Es2与其它鱼的差异其次;判别分析结果表明,判别效果极显著,判别准确率都在90%以上,判别准确率依次为Es1、As1、As2都为100%,Es2为96.2%,Ao为95%,Eo为90%。综合以上分析,根据亚种75%规则,表明雌性奥利亚罗非鱼与雄性鳜间远缘杂交后代与亲本奥利亚罗非鱼不同;为此通过本课题的远缘杂交也许能产生新的养殖品种。

不同投喂模式对奥利亚罗非鱼血液生化指标与生长性能的影响

以奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)为实验对象,设计了3种不同的投喂模式,分别是鲜活饵料组、饥饿3周后饱食投喂组和人工饲料组。鲜活饵料组投喂冰冻赤子爱胜蚓;饥饿后饱食组是指饥饿3周后,以人工饲料饱食投喂2周;人工饲料组作为对照组。淡水养殖,水温(25±2)℃。研究奥利亚罗非鱼在3种投喂模式下某些血液生理生化指标变化的情况,并将指标变化情况与增重率做相关性分析,试图找出能够反映奥利亚罗非鱼生长性能的血液生理生化指标。研究结果表明,奥利亚罗非鱼在饥饿3周后出现补偿生长,补偿生长时的增重率和特定生长率显著高于人工饲料组(P<0.05),高于鲜活饵料组,但差别不显著;相关性分析研究表明血清总蛋白、胆固醇与增重率极显著相关(P<0.01),血红蛋白与增重率显著相关(P<0.05),其他指标与增重率的相关性无统计学意义,因此,建议将血清总蛋白、胆固醇和血红蛋白作为反映生长性能的新指标。

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼核型及DNA含量的比较研究

采用ＰＨＡ体内培养法，取鱼体肾细胞用空气干燥法制备奥利亚罗非鱼（Ｓａｒｏｔｈｅｒｏｄｏｎａｕｒｅａ）和尼罗罗非鱼（Ｓ．ｎｉｌｏｔｉｃａ）的染色体，经核型分析，奥利亚罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。尼罗罗非鱼为２ｎ＝４４，６ｓｍ＋２４ｓｔ＋１４ｔ；ＮＦ＝５０。经流式细胞仪测量外周血红血球的ＤＮＡ含量，奥利亚罗非鱼为２Ｃ＝２．２２ｐｇ（２．２２ｐｇ／Ｎｕｃｌ．）；尼罗罗非鱼为２Ｃ＝２．２７ｐｇ（２．２７ｐｇ／Ｎｕｃｌ．）。经对比分析，两种鱼的核型和ＤＮＡ含量之间的差异不显著，在分类地位上非常接近。

吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼自繁与杂交F_1遗传特性与抗病力分析

以吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼为繁育亲本,采用完全双列杂交繁育4组F1,将初始规格基本一致的4组罗非鱼饲养100 d后,运用“加性-显性”遗传分析模型,分析了4组F1罗非鱼8个生长相关性状杂种优势、遗传效应以及与性状间的相关性。结果表明：（1）F1群体平均优势为0.129 4～0.368 4。除尾柄长超亲优势较大外,其他性状的群体超亲优势较小或表现出负向超亲优势。（2）8个性状的广义遗传率（HB）为0.714 2～0.995 3,表明加性效应和显性效应对性状的遗传变异影响极显著（P〈0.01）。除尾柄长外,其他性状的狭义遗传率（HN）介于0.469 4～0.737 9,表明加性遗传方差在表型方差中所占比率较高。（3）体质量、全长、体长、体高、体宽、头长、尾柄长、尾柄高性状之间表型相关在0.776 6～0.999 7范围内,而遗传相关在0.994 1～1.000 0之间,表明这些性状间都存在极显著的正相关。取样结束后,采用3.95×106CFU/m L的海豚链球菌菌液进行腹腔感染,吉富罗非鱼自繁组F1代12 h后出现死亡,而奥利亚罗非鱼自繁组F1192 h后才出现死亡。384 h后,吉富罗非鱼自繁组F1死亡率为40%,正反交组F1分别为20%和23.3%,奥利亚罗非鱼自繁组F1死亡率最低,为6.67%。研究结果表明,除尾柄长外,杂交F1的其他性状不具备超亲优势,然而杂交可以提高选育后代的抗病力。

奥利亚罗非鱼(♀)、鳜(♂)及其子代间遗传关系的研究

Mature eggs of Oreochromis aurea were obtained with artificial reproduction technology, and the hybrids were acquired with Siniperca chuatsi (♂) using artificial insemination . Genomic DNA of O. aurea (♀), S. chuatsi (♂) and their progeny were examined using RAPD method. Only 2 primers (S336, OPZ06) of screened 11 random primers could be amplified into two specifically RAPD bands on progeny which were the same as those of S. chuatsi (♂) and did not exist in O. aurea (♀), and other amplified bands on progeny were all from O. aurea (♀). Genetic similarity index was 0.858 between the progeny and O. aurea (♀), while that was (0.049) between the progeny and S. chuatsi (♂). This indicated that the genetic substance of progeny was mostly from O. aurea (♀). The primary function of sperm from S. chuatsi (♂) was stimulating development of eggs from O. aurea (♀), at the same time little genetic substance of S.chuatsi(♂) appeared in the progeny, which laid the foundation for breeding of fine varieties having characters of O. aurea (♀) and S. chuatsi (♂).

奥利亚罗非鱼(♀)×鳜(♂)远缘杂交子代的遗传结构

采用RAPD和测序的方法,对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)(♀)与鳜(Siniperca chuatsi)(♂)的杂交子代组合与父母本的遗传关系进行研究,探讨远缘杂交双亲对子代遗传结构的影响。其中,杂交子代包括A、B、C 3个组合,A组合为奥利亚罗非鱼与鳜杂交的F1代;因A组合无雄性,将其与奥利亚罗非鱼(母本)的雄性回交,所得子代为B组合;C组合为B组合间兄妹交的自交子代。结果表明,奥利亚罗非鱼、鳜、A、B和C组合的多态位点比例分别为19.32%、15.30%、41.33%、29.80%和32.31%。奥利亚罗非鱼和鳜间的遗传相似性系数和遗传距离分别为0.288 5和1.243 2。A、B、C组合与父本的遗传相似性系数分别为0.343 4、0.293 7、0.328 7,遗传距离分别为1.068 9、1.225 1、1.112 5;与母本的遗传相似性系数分别为0.903 7、0.916 8、0.922 5,遗传距离分别为0.101 3、0.086 9、0.080 7。本研究中找到一个在杂交A、B及C组合均出现的与父本共有的条带。测序结果表明,该条带长362 bp,在子代与父本中的一致性为100%。研究结果说明,奥利亚罗非鱼和鳜杂交子代中导入了父本遗传物质,导致子代组合的多态性增加,与父本的遗传差异变小,而且,这些遗传物质能稳定进行遗传;随着A组合与母本的回交及B组合的自交,又使得杂交子代的遗传结构向母本靠近。[中国水产科学,2007,14(1):32-38]

奥利亚罗非鱼饥饿后补偿生长对血液理化指标的影响

设计了3种不同的奥利亚罗非鱼摄食类型:A组(鲜活饵料组)、B组(饥饿3周后饱食投喂组)和C组(人工饲料组),研究了奥利亚罗非鱼在不同的摄食类型下血液生理生化指标变化的情况,并试图解释补偿生长时快速生长的机理。实验结果表明,B组补偿生长期间(后2周)的增重率和特定生长率显著高于C组的(P<0.05),高于A组的;B组第4周时血清总蛋白、碱性磷酸酶、钙离子、胆固醇、甘油三脂、血红细胞、血红蛋白与第3周的相比显著上升(P<0.05),且上述指标除碱性磷酸酶外,均高于同时期A组和C组的,因此认为,上述指标的升高促进了细胞的合成代谢,从而实现了补偿生长时的快速生长。

杂交一代(尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂)及其亲本基因组DNA的比较

采用RAPD技术 ,用 2 0个随机引物对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交一代的精巢DNA进行扩增反应 ,发现引物OPZ - 14和OPZ - 18在尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼之间扩增出有差异的DNA片段 ,作为鉴定两种鱼的分子标记有较高可信度。对这两种鱼的杂交一代基因组DNA的RAPD扩增能获得足够的多态性 ,2 0个引物中有 8个引物扩增出差异性产物 ,表明杂交一代基因杂合性增强 ,这是杂种优势得以形成的重要遗传物质基础之一。

奥利亚罗非鱼与鳜杂交的受精细胞学及胚胎发育研究

通过对奥利亚罗非鱼(♀)和鳜(♂)杂交的受精细胞学观察发现:异源精子入卵后产生星光,并核化成雄性原核,与雌原核互相靠近,接触最终完全融合为一个合子核,合子核继续分裂。分析比较了奥利亚罗非鱼,鳜以及奥鳜杂种胚胎发育情况,发现杂种胚胎的发育速度在囊胚早期与母本奥利亚罗非鱼基本一致,到囊胚后期速度有所减慢,但与鳜胚胎发育速度相差很大。这表明奥利亚罗非鱼和鳜虽属不同科间的远缘杂交,但有正常的受精细胞学程序和常规的细胞分裂(卵裂)方式。

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端（RapidamplificationofcDNAends，RACE）法分离出奥利亚罗非鱼（Oreochromisaureus）卵巢芳香化酶（P450aromA）的全序列，得到1784bp的全长cDNA，包括38bp5’非翻译区，1566bp阅读框以及含Poly（A）信号（AATAAA）的167bp3’非翻译区[不包括Poly（A）]。阅读框共编码521个氨基酸，推算的蛋白质分子量为59kD。同源性分析显示，奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其他鱼类性腺芳香化酶（P450arom）具有70％以上的同源性，与其他鱼类脑P450arom有60％左右同源性，但其芳香化酶高保守区包括I．螺旋区、芳香化酶特异保守区和血红素结合区分别与其他鱼类P450arom的同源性高达83％--96％、78％～86％和85％-100％。系统发育分析表明，奥利亚罗非鱼P450aromA属于鱼类性腺P450arom，分子系统进化树分析结果与根据传统的形态学和生化特征分类结果基本一致。生物信息学分析显示，奥利亚罗非鱼P450aromA基因编码的蛋白无信号肽，无跨膜区域，为非分泌型蛋白。同时还含有多个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N．糖基激化位点、N．肉豆蔻酰化位点及蛋白激酶C磷酸化位点。使用Taqman探针法检测P450aromA在奥利亚罗非鱼成鱼各种组织中的表达。结果发现，P450aromA只在卵巢中表达。同时比较了鱼苗、鱼种和成鱼卵巢中P450aromA的表达差异，结果显示，鱼苗中无P450aromA的表达，成鱼中P450aromA的表达量是鱼种阶段的30倍。

尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼性腺的RAPD分析

By using RAPD technique,testes genomic DNA from T.aurea and T.nilotica were analysed.With 20 primers,249 fragments were attained, and the similarity percentage between two species of fish is 89.96%. Species specific fragments were produced respectively by primers OPZ 14 and OPZ 18 between two species of fish.It is suggested that these fragments may be used as molecular markers in fish′s species

我国尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼养殖群体的遗传渐渗

用ＬＫＢ平板电泳仪、４．４％聚丙烯酰胺凝胶对南京罗非鱼良种场尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼养殖群体肌、肝、脑、心、眼中的１０种同工酶进行电泳分析的结果表明，奥利亚罗非鱼的群体未见多态位点，平均杂合度为０，是超“纯”的养殖群体；尼罗罗非鱼群体中有２０％的尼奥杂交鱼，其体形酷似尼罗，难以肉眼鉴别。由此可见，我国尼罗罗非鱼养殖群体中已存在遗传渐渗问题，须注意防杂和提纯。在剔除了杂交鱼后，该场尼罗罗非鱼群体的平均杂合度为０．０４０，ＥＳＴ有多态现象。

一个奥利亚罗非鱼雌性特异性SCAR标记的建立

以奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus为实验材料,通过对800多条随机引物的筛选,获得了1个奥利亚罗非鱼雌性特异性的、长度为1 488 bp的RAPD标记片段RAPD71699-1488,经琼脂糖凝胶电泳后回收、克隆、测序,并根据测序结果设计PCR特异引物,再经PCR条件优化,成功地将该RAPD标记片段转化为实验结果稳定、操作简便的SCAR标记,即SCAROaF1488。采用双重PCR技术,以mtDNA 16S rRNA基因片段为PCR扩增阳性对照,对该标记的有效性在两个群体共200个个体(雌、雄各100个)中进行验证。结果显示,标记检测结果与表型性别的符合度为100%。SCA-ROaF1 488标记的获得为奥利亚罗非鱼遗传性别鉴定及标记辅助选择提供了有效工具,为深入研究鱼类性别相关基因及性别决定机制提供了重要线索和新的思路。

不同组合尼罗罗非鱼(♀)×奥利亚罗非鱼(♂)养殖性能差异研究

用三个尼罗罗非鱼品系和同一种奥利亚罗非鱼生产了三个杂交组合，对他们的雄性率、生长率、成活率及单位面积净产量的比较试验表明：①雄性率为“泰国”（♀）×奥利亚（♂）＞“吉富”（♀）×奥利亚（♂）＞“88”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01）；②绝对增重率为“吉富”（♀）×奥利亚（♂）和“泰国”（♀）×奥利亚（♂）＞“88”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01），瞬时增重率为“吉富”（♀）×奥利亚（♂）和“88”（♀）×奥利亚（♂）＞“泰国”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01）；③成活率为吉富（♀）×奥利亚（♂）和“88”（♀）×奥利亚（♂）＞“泰国”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01）；④单位面积净产量为“吉它”（♀）×奥利亚（♀）＞“泰国”（♀）×奥利亚（♂）＞“88”（♀）×奥利亚（♂）（P＜0．01）。总的说来，养殖性能以“吉富”（♀）×奥利亚（♂）较好，“泰国”（♀）×奥利亚（♂）次之，“88”（♀）×奥利亚（♂）较差。

奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)MyoD1和MyoD2基因全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090bp,包括5′非翻译区(UTR)137bp,3′UTR50bp,开放阅读框(ORF)903bp,编码300个氨基酸,其中第110～161个氨基酸为bHLH结构,第233～249个氨基酸为helixIII结构;MyoD2全长均为1478bp,包括5′UTR215bp,3′UTR471bp,ORF792bp,编码263个氨基酸,其中第91～142个氨基酸为bHLH结构,第212～228个氨基酸为helixIII结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%～92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%～79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支,MyoD1所反映的不同鱼类间的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼[Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus(♀)]进行鉴定。结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。该研究为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。

奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼rDNA内转录间隔区序列特征

核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)是经常被用作种和种群水平系统研究的分子序列。本文分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)内转录间隔区,包括部分18S序列,ITS1、5.8S、ITS2全序列及部分28S序列。4尾奥利亚罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其存在长度不同的a、b两种类型ITS1。a型长为536 bp,GC含量为69.96%;b型长为520 bp,GC含量为69.04%～69.42%。4尾尼罗罗非鱼的10个克隆序列分析表明,其只存在a型ITS1,长为536～540 bp,GC含量为69.42%～70.19%。与b型ITS1相比,a型ITS1在16～31 nt有16 bp片段(GGCCCGCCTGCGGCGC)的插入。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼共20条ITS序列中,5.8S长度均为157 bp,GC含量为56.69%～57.96%;ITS2为408 bp,GC含量为72.79%～74.26%。奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼ITS区序列相似性高达98.2%,表明这两种罗非鱼亲缘关系很近。此外,本文对14尾奥利亚罗非鱼、15尾尼罗罗非鱼以及15尾奥尼罗非鱼[O.aureus(♂)×O.niloticus(♀)]ITS1的扩增结果显示,奥利亚罗非鱼均有a、b两种类型ITS1;15尾尼罗罗非鱼中1尾为a、b两类型ITS1,14尾为a型ITS1;15尾奥尼罗非鱼中则有6尾具有a、b两类型ITS1,9尾为单一的a型ITS1。分析表明,奥利亚罗非鱼在ITS1这个位点一致性高,但尼罗罗非鱼中有1尾混杂了奥利亚罗非鱼的基因,同时也说明分子生物学手段应用于种质鉴定比形态学手段更为精确。

盐酸半胱胺和二氢吡啶对奥利亚罗非鱼生长及相关激素水平、血液生化指标的影响

挑选大小相近的奥利亚罗非鱼270尾,随机分为3组,即对照组(基础日粮)、盐酸半胱胺(CHS)组(基础日粮+150 mg.kg-1CHS)、二氢吡啶(D il)组(基础日粮+100 mg.kg-1D il),试验期为32 d,分别于试验开始第1、15和32天测定体重、激素水平和生理生化指标的变化。结果表明,与对照组相比,CHS组、D il组雄鱼日增重分别提高40.3%、18.1%(P<0.05),特定生长率提高32.8%、16.7%(P<0.05),血中GH水平提高33.0%、11.6%,T3水平提高28.5%、40.4%,睾酮水平提高35.3%、28.7%;雌鱼日增重分别提高15.5%、25.7%,特定生长率提高8.7%、16.7%,GH水平提高34.4%、10.9%,T3水平提高28.1%、46.5%,睾酮水平提高35.3%、28.7%。CHS组和D il组雌、雄鱼脲氮水平明显下降(P<0.05);血清及肝脏抗氧化能力显著增强(P<0.05)。结果提示:CHS和D il均可促进奥利亚罗非鱼的生长,CHS对雄鱼促生长作用较强,D il对雌、雄鱼的促生长作用相似。