三代EGFR-TKI奥希替尼(AZD9291)耐药细胞系建立及耐药标志预测分析

目的建立三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)奥希替尼耐药细胞系(PC9-OR)并分析其耐药标志。方法浓度梯度递增构建奥希替尼耐药PC9细胞系(PC9-OR)。利用生物信息学分析AZD9291耐药细胞株表达谱芯片和测序数据筛选出耐药细胞高表达基因;荧光定量PCR验证表达;Logistics构建回归诊断模型并用ROC曲线验证其诊断效能。结果成功构建PC9-OR耐药细胞株,对3组独立PC9-OR细胞表达谱数据生物信息分析,发现19个基因表达在至少两个数据集中表达上调,3个基因在3个耐药细胞数据集表达均上调。荧光定量PCR检测PC9-OR细胞耐药相关基因有11个表达上调。Logistics回归显示5个基因诊断效能较好,ROC联合诊断模型显示曲线下面积0.985。结论构建了三代EGFR-TKI奥希替尼耐药细胞系PC9-OR,发现一组基因可以作为EGFR-TKI耐药的标志,可能为临床及时发现EGFR-TKI耐药提供依据。

奥希替尼联合贝伐珠单抗对EGFR-TKIs耐药H1975细胞增殖的抑制作用及机制研究

目的:探讨奥希替尼(AZD)联合贝伐珠单抗(BEV)对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)耐药H1975细胞增殖的作用及可能的机制。方法:体外培养人肺腺癌细胞株H1975(E21 L858R/E20 T790M),并通过低浓度加量递增方法诱导建立EGFR-TKIs奥希替尼耐药株H1975/OR。将H1975和H1975/OR细胞分为空白组(不做任何药物处理)、AZD组(不同浓度AZD处理)、BEV组(不同浓度BEV处理)和AZD+BEV组(先加入不同浓度BEV,6 h后加入不同浓度AZD)。分别利用MTT法和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡活性,并计算半数抑制浓度(IC50)和联合应用指数(CI)。Western blotting检测各组细胞EGFR、蛋白激酶B(Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6蛋白激酶(p70s6k)、5-磷酸腺苷激酶(AMPK)蛋白及相应磷酸化蛋白表达量。结果:成功建立AZD耐药细胞株H1975/OR细胞,对AZD的耐药指数为90.57。AZD+BEV抑制H1975细胞增殖的CI分别为0.749、0.790、0.409、0.508、0.298、0.009,CI均<1;抑制H1975/OR细胞增殖的CI分别为0.375、0.111、0.068、0.229、0.592、0.105,CI均<1。AZD+BEV组H1975细胞和H1975/OR细胞凋亡率均高于空白组、AZD组和BEV组(P<0.05)。与空白组、AZD组和BEV组比较,AZD+BEV组H1975细胞和H1975/OR细胞p-EGFR、p-Akt、p-ERK、p-mTOR、p-p70s6k蛋白表达量降低,同时p-AMPK蛋白表达量升高。结论:AZD联合BEV可协同抑制H1975细胞和H1975/OR细胞的增殖活力,其作用机制可能是通过下调VEGF表达进而抑制EGFR及其下游PI3K/AKT/mTOR通路和AMPK/ERK/mTOR通路的磷酸化激活。