大肠杆菌感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制研究

旨在探究大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制。本试验以奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺为研究对象,按试验要求分别随机分成3组:空白对照(Control)组、大肠杆菌(E.coli)组和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组。Control组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺未被E.coli感染;E.coli组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺被感染复数为5或106 CFU的E.coli感染6或24 h,LPS组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺经1μg·mL^(-1)或20 mg·kg^(-1)体重LPS处理6或24 h,奶牛乳腺上皮细胞每组3个重复,小鼠乳腺每组6只小鼠。结果表明:1)奶牛乳腺上皮细胞胞浆中角18蛋白被染成绿色且均匀分布在细胞浆内,细胞核被DAPI染成蓝色。2)正常培养的奶牛乳腺上皮细胞内线粒体结构完整,细胞连接紧密;经E.coli感染的奶牛乳腺上皮细胞细胞间隙增大,线粒体肿胀,线粒体嵴缺失且部分模糊消失。3)E.coli感染或LPS处理使小鼠乳腺腺泡内出现中性粒细胞,且使奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢(D(520 nm)吸光值、ATP的含量、线粒体电子传递链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性降低)、线粒体的融合与分裂(Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn 2和OPA 1 mRNA表达减少)和线粒体的生物发生(PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表达下降)极显著降低(P<0.05,P<0.01)。上述研究表明,E.coli感染主要通过LPS造成奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢紊乱、抑制线粒体分裂与融合以及减少线粒体的生物发生,进而造成线粒体损伤,最终导致乳腺炎的发生。因此,确认E.coli感染是通过诱导线粒体损伤造成奶牛乳腺炎,且线粒体损伤可能是造成乳腺损伤的重要原因之一。

脂噬对奶牛乳腺上皮细胞脂滴大小的调控研究

脂噬是一种新的自噬形式,可以选择性识别脂滴并将其降解,在维持细胞内脂质稳态等过程中发挥着重要的作用。本研究旨在探讨奶牛乳腺上皮细胞经饥饿诱导脂噬后对细胞脂滴大小的调控作用。试验用100μmol·L^(-1)的亚油酸处理细胞24 h,刺激细胞脂滴蓄积,然后分别饥饿诱导细胞0、6、12、24、48 h,油红O染色观察细胞内脂滴的尺寸和数量随饥饿时间的变化情况,随后饥饿诱导24 h通过免疫荧光观察脂滴和自噬蛋白LC3的共定位,蛋白免疫印迹检测细胞内自噬蛋白LC3和P62的表达,透射电镜观察脂滴自噬情况。结果发现:随着饥饿处理时间的延长,脂滴直径从1.57μm显著增加到2.12μm,每个细胞的脂滴数量显著减少,从39个·cell^(-1)减少到24个·cell^(-1),大脂滴比例显著增加,小脂滴比例显著减少(P<0.05),免疫荧光发现LC3与脂滴发生共定位,透射电镜观察发现自噬溶酶体包裹着脂滴,饥饿处理24 h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的比值显著增加1倍,P62蛋白表达显著下降(P<0.05)。以上结果表明,脂噬对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的大小发挥调控作用。

miR-223对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的影响

以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞(dairy cow mammary epithelial cell,DCMECs)为研究模型,探讨mi R-223对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的DCMECs炎症反应与乳脂合成的影响。应用Western blot检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)与脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)的表达情况,通过脂质体转染技术将mi R-223转染至DCMECs,qRT-PCR检测mi R-223的相对表达量,采用原位荧光技术分别检测DCMECs的凋亡与乳脂合成能力。结果表明LPS诱导DCMECs炎症反应的最佳浓度为1μg/m L;添加LPS可促进DCMECs mi R-223的表达;DCMECs转染mi R-223后,mi R-223的表达显著上调;mi R-223可下调LPS诱导的DCMECs炎症蛋白因子TNF-α,上调乳脂合成相关蛋白FASN,抑制LPS诱导的细胞凋亡,促进LPS诱导的乳脂合成。

蜂胶中多酚化合物对奶牛乳腺炎的缓解作用及机制研究进展

奶牛乳腺炎主要是由病原体感染等多方面因素引起的炎症性疾病,导致泌乳量和乳品质大幅下降,给奶牛养殖业和乳制品行业带来严重经济损失。乳腺炎可能受NF-κB、MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT-mTOR和Nrf2-ARE等信号通路调控。蜂胶是由蜜蜂工蜂采集植物树脂,并加入其蜡腺、上颚腺等分泌物加工形成,其主要活性成分是多酚化合物,可通过杀灭奶牛乳腺炎病原、降低炎症反应、作为疫苗佐剂等方式有效缓解奶牛乳腺炎。本文概述了乳腺炎的作用机制,总结了蜂胶提取物及多酚缓解奶牛乳腺炎的作用效果,为更好地将蜂胶中多酚化合物应用于奶牛乳腺炎防治提供理论依据。

乙酰乙酸通过抑制Nrf2诱导奶牛乳腺上皮细胞线粒体损伤

为探究乙酰乙酸(Acetoacetic acid,ACAC)是否通过抑制核转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor E2-reate d factor2,Nrf2)导致奶牛乳腺上皮细胞线粒体损伤。在奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)中添加0、0.6、1.2或1.8 mmol·L-1ACAC处理24 h;用10μmol·L-1的萝卜硫素(Sulforaphane,SFN)预处理MAC-T 24 h后,加入1.2 mmol·L-1ACAC处理24 h。流式细胞术检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS);采用JC-1染色检测线粒体膜电位变化情况;通过q-PCR测定线粒体氧化磷酸化复合物Ⅰ-Ⅴ(Oxidative phosphorylation complexesⅠ-Ⅴ,COⅠ-Ⅴ)的基因表达情况以及线粒体生物合成调节因子Nrf2、过氧化物酶体增殖体激活受体γ-γ活化剂1-α(Peroxlsome proliferator-activated re ceptor-γ coac tlvator-1α,PGC-1α)、线粒体转录因子A (Mitoc hondrial transcription factor A,TFA M)、核呼吸因子-1 (Nuclear respiratory fac tor-1,Nrf1)、线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mt DNA);使用试剂盒检测腺嘌呤核苷三磷酸(A denosine triphosphate,ATP)含量。结果显示,ACAC处理后,ROS的含量显著升高(P<0.05),而线粒体膜电位显著下降(P<0.05),并且COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的m RNA表达水平显著降低(P<0.05),PGC-1α、TFAM、Nrf1以及Nrf2的m RNA表达量显著下降(P<0.05),mtDNA含量显著降低(P<0.05),ATP含量显著降低(P<0.05),而SFN预处理缓解了上述影响。结果表明,ACAC通过抑制Nrf2信号通路诱导了MAC-T细胞线粒体损伤。

白藜芦醇缓解脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤和细胞凋亡

本试验旨在研究白藜芦醇(RES)对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎性损伤和细胞凋亡的影响。试验采用LPS诱导构建炎性损伤bMECs模型,采用单因子随机试验设计方法,构建对照组(CON组,用饥饿培养基孵育bMECs 24 h)、LPS组(用含10μg/mL LPS配制的饥饿培养基孵育bMECs 24 h)、RES组(用含15μmol/L RES配制的饥饿培养基孵育bMECs 24 h)和RES+LPS组(用含10μg/mL LPS+15μmol/L RES共同配制的饥饿培养基孵育bMECs 24 h)。结果表明:1)与0μg/mL LPS相比,10μg/mL的LPS处理bMECs 24 h显著或极显著降低细胞活力和bMECs中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子2(Nrf2)和线粒体转录因子A(TFAM)的mRNA相对表达水平(P<0.05或P<0.01),极显著提高了bMECs中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和丙二醛(MDA)的mRNA相对表达水平(P <0.01),表明bMECs炎性损伤模型构建成功。RES缓解炎性损伤bMECs的适宜浓度为15μmol/L。2)与CON组相比,LPS组的bMECs中IL-8、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、MDA、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA相对表达水平显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),PGC-1α、TFAM和B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的mRNA相对表达水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01);与LPS组相比,RES+LPS组的bMECs中IL-8、TNF-α、MDA和Bax的mRNA相对表达水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),PGC-1α、TFAM和Bcl-2的mRNA相对表达水平极显著升高(P<0.01)。由此可见,外源添加RES可起到缓解LPS诱导的bMECs线粒体损伤、氧化应激、炎性反应和细胞凋亡,为在奶牛生产中推广应用RES奠定了技术支撑。

表没食子儿茶素没食子酸酯对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤和凋亡的干预作用

【目的】探究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)炎症和凋亡的影响及其潜在的保护机制。【方法】利用LPS诱导BMECs构建细胞炎症模型。通过CCK-8检测细胞活力,筛选EGCG最佳浓度。将BMECs分为对照组、LPS处理组和EGCG+LPS共处理组,利用实时荧光定量PCR检测细胞中炎性因子、凋亡因子以及抗氧化相关基因mRNA表达水平;利用试剂盒检测BMECs的线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平;通过流式细胞术检测BMECs凋亡情况。【结果】使用LPS处理BMECs后,与0 h相比,各时间段细胞中炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-8和IL-1β基因mRNA表达量均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),成功构建BMECs细胞炎性损伤模型。CCK-8检测细胞活力结果显示,EGCG最佳作用浓度为5μmol/L。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,LPS诱导的BMECs中IL-6、IL-8、丙二醛(MDA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)基因mRNA表达量均极显著升高(P<0.01),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、B细胞淋巴瘤蛋白-2(Bcl-2)基因mRNA表达量极显著降低(P<0.01);与LPS组相比,EGCG+LPS组细胞中IL-6、IL-8、IL-1β、MDA、Bax和Caspase-3基因mRNA表达量均显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01),GSH-Px、超氧化物歧化酶(SOD)、Bcl-2基因mRNA表达量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。线粒体膜电位检测结果显示,与对照组相比,LPS组BMECs红色荧光明显减弱,绿色荧光有所增强,而EGCG和LPS共孵育后则对BMECs红色荧光没有明显影响,绿色荧光相对减弱;ROS水平检测结果显示,与对照组相比,LPS组细胞绿色荧光明显增强,而EGCG和LPS共孵育后,细胞绿色荧光有所减弱。流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,LPS处理后死亡细胞和凋亡细胞明显增多,细胞凋亡率极显著升高(P<0.01),而EGCG和LPS共孵育后凋亡细胞则明显减少,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。【结论】EGCG可以通过抑制LPS诱导BMECs中ROS释放和缓解线粒体损伤等综合作用,缓解炎性反应并抑制细胞凋亡,研究结果为EGCG预防和治疗奶牛乳腺炎提供理论基础。

丹皮酚对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的缓解作用

旨在探究丹皮酚对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)炎性损伤的缓解作用。使用CCK-8法检测不同浓度丹皮酚对BMECs活力的影响,选用20、50和100 mg/L丹皮酚处理LPS诱导的BMECs炎性模型,并检测细胞凋亡、氧化应激因子、相关炎性因子及NF-κB关键通路蛋白表达的变化。结果显示:10~100 mg/L丹皮酚对BMECs增殖有不同程度的促进作用;不同剂量的丹皮酚可显著抑制细胞凋亡及IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平,提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,降低丙二醛(MDA)含量,抑制IκBα和p65的磷酸化水平。以上结果表明,丹皮酚能够抑制LPS诱导的BMECs的炎性损伤,其作用机制可能与NF-κB信号通路被抑制有关。

顺9,反11-共轭亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞氧化应激损伤的影响研究

试验旨在研究顺9,反11-共轭亚油酸(c9,t11-CLA)对H_(2)O_(2)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)氧化损伤的保护作用。将分离纯化后的BMECs用不同的H_(2)O_(2)浓度和作用时间培养,以建立细胞氧化损伤模型;再在培养基中添加不同浓度(0、200、400、600、800μmol/L)的c9,t11-CLA培养BMECs 24 h,以确定c9,t11-CLA适宜的添加浓度;通过前期结果选用浓度为600μmol/L的H_(2)O_(2)和100μmol/L的c9,t11-CLA进行后续试验。试验设置3个组,分别为对照组、H_(2)O_(2)组、c9,t11-CLA+H_(2)O_(2)组,每组6个重复。对照组只用DMEM/F12基础培养基;H_(2)O_(2)组在基础培养基处理24 h后,再用600μmol/L H_(2)O_(2)培养细胞8 h;c9,t11-CLA+H_(2)O_(2)组在基础培养基中添加100μmol/L c9,t11-CLA处理24 h后,再用600μmol/L H_(2)O_(2)培养细胞8 h。试验对细胞内的丙二醛(MDA)活性、总抗氧化活性(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性等指标进行检测,并用RT-PCR法测定细胞的SOD、CAT和GSH-Px的mRNA表达量。结果表明:与对照组相比,H_(2)O_(2)组的T-AOC活力(P<0.05)及SOD、CAT、GSH-Px活性(P<0.01)均下降,MDA含量上升(P<0.05),抗氧化酶SOD、CAT和GSHPx的mRNA表达量下降(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,c9,t11-CLA+H_(2)O_(2)组BMECs的SOD、CAT和GSHPx活性(P<0.05)及其基因的mRNA表达量(P<0.05)均有提高,MDA含量降低(P<0.05)。由此可见,c9,t11-CLA可以提高H_(2)O_(2)诱导的奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力,为奶牛乳腺抗氧化剂的选择提供数据支撑。

维生素A和乙酸交互作用对奶牛乳腺上皮细胞中乳成分合成相关基因表达的影响

【目的】在前期研究发现维生素A(VA)对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)内乳脂和乳蛋白合成相关基因表达具有显著促进效果的基础上,以奶牛乳腺上皮细胞为研究对象,添加乳脂肪合成前体物乙酸(acetic acid,AA),旨在探究VA和AA二者在乳成分合成相关基因表达上是否存在互作关系,借此更系统地了解VA参与乳脂、乳蛋白合成的调控机制,为奶牛饲料中合理添加VA及改善乳品质提供科学依据。【方法】采用胶原酶消化法培养细胞,将第三代BMECs分为6个处理组,分别加入不同浓度的VA和AA混合工作液,6个处理组依次命名为对照组(0 mg·mL^(-1)VA+0 mol·L^(-1)AA)、AA处理1组(0 mg·mL^(-1)VA+0.006 mol·L^(-1)AA)、AA处理2组(0 mg·mL^(-1)VA+0.01 mol·L^(-1)AA)、VA处理组(0.001 mg·mL^(-1)VA+0 mol·L^(-1)AA)、VAAA1组(0.001 mg·mL^(-1)VA+0.006 mol·L^(-1)AA)和VAAA2组(0.001 mg·mL^(-1)VA+0.01 mol·L^(-1)AA)。培养结束后收集细胞和培养液样品,采用MTT法测定细胞增殖率;采用试剂盒法测定甘油三酯含量、乳脂和乳蛋白合成关键酶的活性;采用实时定量PCR技术测定并计算乳脂和乳蛋白合成相关基因的相对表达量。【结果】添加VA后显著提高了细胞增殖率(P<0.001),但添加AA、VA与AA的组合效应均对细胞增殖率无显著影响(P>0.05)。VA和AA在乳脂合成方面存在互作效应,AA能提高BMECs内的甘油三酯(TG)含量(P=0.01),同步添加VA则对TG的合成产生明显的抑制作用(P=0.01);AA能提高细胞内脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)的活性及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)基因的表达(P<0.05;P<0.05;P<0.001),同时添加VA则极显著地抑制(P<0.001;P=0.01;P<0.01);AA显著提高了BMECs内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)含量(P=0.05)、p70核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)酶活性(P<0.001),并上调了κ-酪蛋白(CSN3)的基因表达(P<0.001),mTOR与β-酪蛋白(CSN2)的基因表达受到两者互作效应的影响(P=0.02),同时添加VA与AA时会减弱单独添加VA或AA后对mTOR与CSN2的基因表达的下调作用。【结论】AA处理组2对乳脂合成的促进效果较好,VAAA2组较弱;AA处理1组对乳蛋白合成促进作用较好,VAAA1组较弱。因此,单独添加0.01 mol·L^(-1)的AA对促进乳脂合成较好,0.006 mol·L^(-1)的AA则更利于乳蛋白的合成。

白细胞介素-1受体拮抗剂对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用

本试验以脂多糖(LPS)作为应激源,诱导奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)氧化损伤,旨在探究白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)对LPS诱导的BMEC氧化损伤的保护作用,并确定抑制细胞氧化损伤的适宜IL-1Ra浓度。第3代贴壁生长的BMEC被随机分为12个组:对照组(无LPS,无IL-1Ra)、LPS组(1.0μg/mL LPS)、单独添加IL-1Ra(0.25、0.50、1.00、5.00和10.00 ng/mL)组、同时添加IL-1Ra与LPS(0.25 ng/mL IL-1Ra+1.0μg/mL LPS、0.50 ng/mL IL-1Ra+1.0μg/mL LPS、1.00 ng/mL IL-1Ra+1.0μg/mL LPS、5.00 ng/mL IL-1Ra+1.0μg/mL LPS、10.00 ng/mL IL-1Ra+1.0μg/mL LPS)组,每组设6个重复。不同处理的工作液作用于细胞6 h后,测定细胞相对增殖率(RGR),并且收集细胞和培养液测定抗氧化指标和炎性因子含量。结果显示:与对照组相比,单独添加不同浓度的IL-1Ra对RGR、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)、硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)、过氧化氢酶(CAT)活性与总抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)含量均无显著影响(P>0.05);但是,单独添加不同浓度IL-1Ra对白细胞介素-1(IL-1)的生成有显著的抑制效果(P<0.05)。与LPS组相比,同时添加LPS和1.00 ng/mL IL-1Ra能显著提高RGR(P<0.05),显著增加GPx1和超氧化物歧化酶(SOD)活性与T-AOC,并显著降低IL-1、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、iNOS、NO含量(P<0.05)。结果提示,单独添加IL-1Ra可以专一性的抑制BMEC内IL-1的产生,对细胞氧化应激的影响不显著;LPS加速了BMEC氧化还原水平的失衡,IL-1Ra可有效抑制LPS诱导的细胞氧化损伤,且IL-1Ra的适宜作用浓度为1.00 ng/mL。

不同剂量亚油酸和油酸添加对泌乳奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成的影响

本试验旨在研究不同剂量亚油酸和油酸添加对泌乳奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成的影响。试验以泌乳奶牛乳腺上皮细胞为研究对象。试验共2部分,试验1以不添加脂肪酸作为对照组,试验组分别添加100μmol/L油酸、100μmol/L亚油酸、100μmol/L油酸+100μmol/L亚油酸。试验2以单独添加100μmol/L油酸作为对照组,试验组在添加100μmol/L油酸的基础上分别添加25、50、75μmol/L亚油酸,每组6个重复。试验测定乳腺上皮细胞活力、甘油三酯相对含量、乳脂合成相关基因的mRNA相对表达量。结果表明:1)试验1,与对照组相比,单独或混合添加油酸和亚油酸均显著提高了乳腺上皮细胞活力(P<0.05),单独添加油酸或亚油酸均显著提高了甘油三酯相对含量(P<0.05),但混合添加未显著影响甘油三酯相对含量(P>0.05);单独添加油酸显著提高了乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、1-单酰甘油-3-磷酸酰基转移酶6(AGPAT6)、3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAM)的mRNA相对表达量(P<0.05),单独添加亚油酸显著提高了AGPAT6、固醇调节元件结合蛋白1(SREBF1)的mRNA相对表达量(P<0.05),混合添加等量油酸和亚油酸显著降低了ACACA、SREBF1、分化抗原簇36(CD36)、酰基辅酶A合成酶1(ACSL1)的mRNA相对表达量(P<0.05)。2)试验2,固定油酸添加量,增量添加亚油酸对甘油三酯相对含量无显著影响(P>0.05);100μmol/L油酸和25μmol/L亚油酸混合添加显著增加了ACACA、SREBF1的mRNA相对表达量(P<0.05),显著降低了脂肪酸结合蛋白3(FABP3)的mRNA相对表达量(P<0.05);100μmol/L油酸和50μmol/L亚油酸混合添加显著增加了脂肪酸合成酶(FASN)、硬酯酰辅酶A去饱和酶(SCD)、CD36、AGPAT6、二脂酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)、GPAM、磷脂酸磷酸酶(LPIN1)的mRNA相对表达量(P<0.05),显著降低了过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)的mRNA相对表达量(P<0.05);100μmol/L油酸和75μmol/L亚油酸混合添加显著增加了ACACA、FASN、SREBF1、PPARG的mRNA相对表达量(P<0.05),显著降低了AGPAT6的mRNA相对表达量(P<0.05)。试验结果提示,亚油酸的添加量是亚油酸和油酸混合添加时调控乳腺上皮细胞乳脂合成的重要因素。

植物提取物复合制剂缓解奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制

本试验旨在研究植物提取物复合制剂对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)炎症模型免疫、抗氧化功能和转录组的影响,以揭示植物提取物复合制剂缓解BMEC炎症反应的分子机制。试验选用第3代贴壁生长BMEC,随机分为5组,每组8个重复,每个重复1个培养孔。对照组BMEC不添加LPS和植物提取物复合制剂,采用基础培养基培养10 h;LPS组BMEC添加10μg/mL LPS作用6 h后,采用基础培养基培养4 h;试验组BMEC加入10μg/mL LPS作用6 h后,分别加入30(WELPS30组)、50(WELPS50组)及70μg/mL(WELPS70组)的植物提取物复合制剂,采用基础培养基培养4 h。测定各组免疫及抗氧化相关指标,并选择LPS组和WELPS30组进行转录组测序及分析。结果表明:1)LPS组BMEC相对增殖率显著低于对照组(P<0.05),WELPS30组BMEC相对增殖率显著高于LPS组(P<0.05),且WELPS30组、WELPS50组和WELPS70组BMEC中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-8(IL-8)含量显著低于LPS组(P<0.05)。2)LPS组BMEC中丙二醛(MDA)含量和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)活性显著高于对照组(P<0.05),WELPS30组、WELPS50组和WELPS70组BMEC中MDA含量和iNOS活性显著低于LPS组(P<0.05),WELPS30组BMEC中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)显著高于LPS组(P<0.05)。3)转录组测序结果表明,共有369个差异表达基因。GO富集分析显示,差异表达基因主要参与调节白细胞介素-17(IL-17)生成、白细胞介导的细胞毒素作用、T细胞增殖等生物学过程。KEGG富集分析显示,差异表达基因主要集中在以NOD样受体(NLR)信号通路和IL-17信号通路为主的免疫相关信号通路。4)以介数中心性为指标进行网络分析,发现Toll样受体2(TLR2)、趋化因子10(CXCL10)和集落刺激因子2(CSF2)等10个基因在植物提取物复合制剂调控的差异表达免疫基因中起到关键连接性作用。由此可见,植物提取物复合制剂可以提高BMEC抗氧化功能,缓解BMEC炎症反应,其分子机制是植物提取物复合制剂通过调节IL-17信号通路和NLR信号通路缓解BMEC的炎症反应,TLR2、CXCL10和CSF2等10个基因在差异表达免疫基因中起到关键性的连接作用。

抑制PERK对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬的影响

旨在研究PERK在脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬中的作用。首先,试验设对照组(CON)和LPS组(LPS,4μg·mL^(-1)),研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞内质网应激和自噬的影响;随后用不同浓度的PERK抑制剂GSK2606414(GSK)预处理细胞,通过测定PERK、ATF4、eIF-2α和CHOP的mRNA表达,筛选出GSK的最佳抑制浓度;最后将奶牛乳腺上皮细胞分为对照组(CON)、LPS组(LPS)、GSK+LPS组(GLPS)和GSK组4组,研究抑制PERK对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬的影响。采用RT-qPCR和Western blot分析内质网应激、自噬相关基因和蛋白的表达,通过免疫荧光检测GRP78和p62的荧光强度。结果表明:1)与对照组相比,LPS组的PERK、IRE1α、ATF6、GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高。LPS还可以显著升高LC3、ATG5、ATG14和Beclin1的mRNA和蛋白表达(P<0.01),并且显著降低p62的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。此外,LPS可降低p62的荧光强度、升高GRP78的荧光亮度以及增加溶酶体的形成;2)与LPS组相比,GSK预处理可显著降低PERK、ATF4、eIF-2α、CHOP蛋白表达(P<0.05或P<0.01),并且还可以显著降低LC3、ATG14、ATG5、Beclin1以及升高p62的mRNA和蛋白表达(P<0.01或P<0.05)。免疫荧光试验结果进一步表明,GSK预处理可增加p62的荧光强度。因此,在本研究背景下,LPS可诱导奶牛乳腺上皮细胞发生内质网应激和自噬,并且抑制PERK/eIF-2α/ATF4信号通路可缓解LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞自噬。

维生素A对一氧化氮诱导损伤的奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成下降的缓解作用

本试验旨在研究添加维生素A对一氧化氮(NO)诱导损伤的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳蛋白合成下降的缓解作用。试验采用单因子完全随机试验设计,以二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)作为氧化应激源,将第3代BMECs随机分为9组,分别为对照组(CON组)、NO损伤组(NO组)和NO损伤+不同浓度(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00μg/mL)维生素A预保护组(NA0.05、NA0.1、NA0.2、NA0.5、VA1、VA2和NA4组),每组4个重复。待细胞生长融合至80%~90%后,使用无血清培养基饥饿培养12 h后,CON组不添加维生素A和DETA/NO继续培养30 h;NO组不添加维生素A培养24 h后,再添加1000μmol/L的DETA/NO继续培养6 h;NA0.05、NA0.1、NA0.2、NA0.5、VA1、VA2和NA4组分别添加0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00μg/mL的维生素A培养24 h后,再添加1000μmol/L DETA/NO继续培养6 h。结果显示:与CON组相比,NO组细胞的相对增殖率以及细胞内硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、p70核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)活性与总抗氧化能力(T-AOC)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)含量以及αs1-酪蛋白(CSN1S1)、β-酪蛋白(CSN2)、κ-酪蛋白(CSN3)、mTOR、S6K1、真核起始因子4E(eIF4E)、真核起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、信号转导和转录激活因子5(STAT5)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),诱导型氧化氮合酶(iNOS)活性、活性氧(ROS)和NO含量显著升高(P<0.05)。与NO组相比,NA0.2~NA4组TrxR、CAT、GPx活性与T-AOC显著升高(P<0.05);NA0.2~NA1组CSN1S1的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05);NA1组S6K1活性和GPx1、CSN2和酪氨酸激酶2(JAK2)的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),NO和ROS含量显著下降(P<0.05);NA4组mTOR、S6K1、4EBP1和eIF4E的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05),iNOS活性显著下降(P<0.05);NA2、NA4组mTOR含量、TrxR和STAT5的mRNA相对表达量显著上调(P<0.05)。综上可知,NO诱导损伤BMECs后导致其细胞活力、抗氧化能力和乳蛋白合成相关酶活性及基因表达的下降;维生素A对NO诱导损伤的BMEC内乳蛋白合成下降有缓解作用,其效果以0.20~2.00μg/mL较好,尤以1.00μg/mL最好。

维生素A缓解H_(2)O_(2)诱导损伤的奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成下降的研究

试验旨在研究添加维生素A(VA)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导损伤的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳蛋白合成下降的缓解作用。试验以H_(2)O_(2)作为氧化应激源,将贴壁的第三代BMECs随机分成9个处理组,分别为对照组(CON组)、H_(2)O_(2)损伤组(H_(2)O_(2)组,生长培养基处理24 h后,换含有H_(2)O_(2)的培养基继续培养6 h)以及H_(2)O_(2)损伤组+不同水平VA预保护组,分别添加0.05(0.05HA组)、0.10(0.10HA组)、0.20(0.20HA组)、0.50(0.50HA组)、1.00(1.00HA组)、2.00(2.00HA组)、4.00 mg/L(4.00HA组)的VA,各VA预保护组只添加含相应VA的培养基处理24 h后,再换含有H_(2)O_(2)、VA的培养基继续处理6 h,每组6个重复。结果显示,与CON组相比,H_(2)O_(2)组αs1-酪蛋白(CSN1S1)、β-酪蛋白(CSN2)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的含量以及CSN1S1、m TOR、真核起始因子4E(eIF4E)、酪氨酸激酶2(JAK2)、信号转导和转录激活因子5(STAT5)的基因表达显著降低(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,1.00HA组~4.00HA组CSN1S1、CSN2的含量及p70核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)的酶活性显著升高(P<0.05);2.00HA组mTOR含量显著升高(P<0.05);各VA预处理组eIF4E的基因表达显著升高(P<0.05);0.10HA组~4.00HA组CSN1S1、k-酪蛋白(CSN3)、STAT5的基因表达显著升高(P<0.05);0.20HA组~4.00HA组CSN2的基因表达显著升高(P<0.05);0.20HA组及1.00HA组~4.00HA组mTOR的基因表达显著升高(P<0.05);1.00HA组~4.00HA组S6K1、真核起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)的基因表达显著升高(P<0.05)。研究表明,H_(2)O_(2)诱导损伤BMECs后导致乳蛋白合成相关酶活性及基因表达下降;VA对H_(2)O_(2)诱导损伤的BMECs内乳蛋白合成下降具有缓解作用,效果以0.20HA组~4.00HA组较好,以1.00 mg/L VA最好。

重组克柔念珠菌14-3-3蛋白诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制

旨在研究重组克柔念珠菌(Candida krusei)14-3-3蛋白(rCK14-3-3)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的分子机制,为系统研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供理论依据。采用原核表达的方法构建克柔念珠菌BMH 1基因重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导表达纯化后进行Western blot鉴定;CCK-8法筛选rCK14-3-3蛋白对MAC-T的最适作用浓度和时间;Western blot检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T的Toll样受体、MAPK信号通路、NF-κB信号通路主要蛋白相对表达量的影响;ELISA检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T中相关炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-12相对表达量的影响。结果显示:成功构建了pET-21a-BMH1重组表达载体,经诱导表达纯化后获得有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,纯度达90%以上,浓度为0.2 mg·mL^(-1)。与空白对照组相比,采用50μg·mL^(-1)的rCK14-3-3作用MAC-T,TLR2、TLR4、MyD88在1、3 h时表达量极显著升高(P<0.01),6 h时,TLR4表达量显著降低(P<0.05),TLR2、MyD88表达量无显著变化;p-JNK在1 h时的表达量无显著变化,3、6 h时极显著降低(P<0.01);p-ERK在1、3、6 h时的表达量显著或极显著升高(P<0.05,P<0.01);p-p38在1 h时的表达水平极显著降低(P<0.01),3、6 h时极显著升高(P<0.01);p-IκB-α、p-p65在1、3、6 h时的表达量均极显著升高(P<0.01)。IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α在作用1、3、6 h后均呈现出显著或极显著的上调趋势(P<0.05,P<0.01);IL-6在作用1、3 h后极显著上升(P<0.01),6 h后显著降低(P<0.05);IL-12在作用1 h后极显著上升(P<0.01),3、6 h后极显著降低(P<0.01)。本研究成功表达具有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,该蛋白可通过TLR2/4-MAPK/NF-κB信号通路诱导MAC-T发生炎性反应,rCK14-3-3蛋白可作为引起MAC-T炎症的重要因子之一。

必需氨基酸调控奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的研究进展

乳蛋白含量的高低是衡量乳品质的重要指标,奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)是乳腺合成乳蛋白的基本功能单位。必需氨基酸(EAA)作为乳成分前体物质,其不仅是乳蛋白合成的底物,而且可以作为信号分子调控乳蛋白的合成。本文综述了近年关于EAA对BMECs乳蛋白合成的影响及其潜在的信号通路机制的研究进展,为今后系统研究氨基酸对BMECs乳蛋白合成的调控及提高泌乳奶牛氨基酸转化为乳蛋白的效率提供参考。

bta-miR-29d-3p对奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢相关基因表达及甘油三酯含量的影响

为探索bta-miR-29d-3p与奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢相关基因表达及甘油三酯含量之间的调控关系,试验设计并合成bta-miR-29d-3p的模拟物和抑制物,通过瞬时转染技术将bta-miR-29d-3p的模拟物和抑制物转染到奶牛乳腺上皮细胞中,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测bta-miR-29d-3p抑制或过表达后奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因表达水平的变化,细胞内甘油三酯含量用试剂盒检测。结果显示:bta-miR-29d-3p过表达后甘油三酯合成相关基因二酰甘油酰基转移酶(DGAT1)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM),脂肪酸合成相关基因乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)、脂肪酸合成酶(FASN),转录因子固醇调节元件结合蛋白1(SREBF1)的表达量显著降低(P<0.01),肝X受体Α(LXRA)表达量显著上升(P<0.01)。同时过表达bta-miR-29d-3p奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。干扰bta-miR-29d-3p显著增加了DGAT1、ACACA、FASN、GPAM、转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG1)(P<0.01)和SREBF1(P<0.05)的表达量,同时甘油三酯含量显著增加(P<0.05)。说明bta-miR-29d-3p通过改变乳脂代谢相关基因和甘油三酯水平,从而调节奶牛乳脂代谢。

蛋氨酸二肽对Transwell小室培养的奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白合成的影响

为明确奶牛乳腺中小肽的吸收和利用机制,本试验研究了蛋氨酸二肽(Met-Met)在Transwell小室培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)中的摄取及其对乳蛋白合成的影响。首先将BMECs培养在Transwell小室中,待BMECs形成细胞层后,分别在Transwell上室和下室培养液中添加0.5 mmol/L的Met-Met,以不添加Met-Met作为对照。培养24 h后,收集BMECs,采用Western blot检测β-酪蛋白(β-casein)和小肽转运载体2(PepT2)蛋白的相对表达量以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。结果显示:BMECs在Transwell小室中培养6 d后,细胞层跨膜电阻达到平台期,反映细胞层紧密性良好;Transwell上室和下室培养液中添加Met-Met显著增加了BMECs中β-casein和PepT2的蛋白相对表达量(P<0.05);Transwell下室培养液中添加Met-Met显著提高了mTOR、S6K1和AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。以上结果表明,Transwell上室和下室培养液中的Met-Met均可被BMECs摄取用于乳蛋白的合成,PepT2在BMECs基底膜小肽吸收和顶膜小肽重吸收过程中发挥重要作用,基底膜Met-Met通过激活mTOR和AKT信号通路促进乳蛋白的合成。