催乳素、雌激素和胰岛素对奶牛乳腺细胞酪蛋白表达的影响

采用乳腺组织块法体外培养奶牛乳腺细胞,添加外源催乳素、雌激素和胰岛素,运用高效液相色谱技术观察乳腺细胞酪蛋白的表达情况,结果表明,同空白对照组相比,添加催乳素、雌激素和胰岛素后,乳腺细胞表达酪蛋白的量明显增强。

FADS2基因在奶牛乳腺细胞中的过表达和干扰研究

为了研究脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturases 2,FADS2)基因在奶牛乳腺细胞脂肪酸代谢中的作用,本研究在奶牛乳腺上皮细胞中对FADS2基因进行过表达和干扰,研究FADS2基因表达对脂肪酸合成相关基因的调控及对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的影响。针对FADS2基因的CDS序列设计siRNA和过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP,转染奶牛乳腺细胞检测FADS2基因过表达和干扰对脂肪酸代谢相关基因表达的影响及细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示,试验成功获得过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP和干扰片段,转染细胞后具有良好的过表达和干扰效果。FADS2基因过表达后,1-酰基甘油磷酸酰基转移酶(AGPAT1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、3-磷酸甘油转移酶(GPAM)、脂肪酸延长链5(ELOVL5)、乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)、脂肪酸脱氢酶1(FADS1)、二酰基甘油转酰基酶1(DGAT1)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因显著下调(P<0.05),脂滴蛋白2(PLIN2)基因极显著上调(P<0.01)。FADS2基因干扰过后可引起AGPAT1、GPAM、ELOVL5、ACAA1、PLIN2和FADS1基因显著上调(P<0.05),脂肪酸合成胰岛素诱导基因1(INSIG1)极显著上调(P<0.01),DGAT1和PPARα基因显著下调(P<0.05)。甘油三酯检测结果显示,FADS2基因过表达和干扰均可降低奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,FADS2基因能调控脂质合成相关基因的表达,对乳腺脂质合成具有调控作用。

黄花蒿醇提物对奶牛乳腺细胞中共轭亚油酸合成相关酶基因表达的作用

【目的】通过奶牛乳腺上皮细胞体外培养试验,研究黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中与共轭亚油酸(CLA)合成相关酶的基因SCD表达的影响,探讨其对乳脂肪合成相关酶ACACA和FASN基因以及与脂肪转运相关酶LPL基因表达的影响,旨在从乳腺层次探明黄花蒿乙醇提取物对乳中CLA合成的部分作用机制。【方法】将采自于健康泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺组织用保温盒带回实验室,在无菌条件选取腺泡较多的深层组织,采用胶原酶消化法获得乳腺上皮细胞,放于37℃,CO2浓度为5%的培养箱中进行原代培养。试验所用的细胞是经过复苏的第二代细胞,待细胞复苏后,以3×10^4个/mL的密度接种细胞到24孔板中,分别置于37℃的5%CO2培养箱中培养,采用台盼蓝计数法每天进行一次计数,设3个重复,连续7 d,未计数组每2天换液一次,绘制细胞生长曲线。另外,待细胞生长至对数增殖期,更换新鲜培养液,随机分为4组,即培养液中黄花蒿提取物的浓度为0、3.0、6.0、12.0 mg·L^-1,提取物作用时间均为48 h,检测不同浓度黄花蒿提取物对与脂肪酸合成相关酶SCD、ACC、FAS、LPL基因表达量的影响。每个处理3个重复。【结果】使用倒置显微镜观察,乳腺上皮细胞形态呈铺路石样;在3×10^4个/mL的接种密度下,细胞生长曲线呈S型,在1—2d乳腺上皮细胞为潜伏期,3—6d为指数增长期,之后进入平台期,符合一般细胞生长曲线规律,说明培养的乳腺上皮细胞具有正常的增殖能力,可以用于后续的研究;与对照组相比,添加黄花蒿乙醇提取物有增加SCD酶基因表达量的趋势,其中3mg·L^-1组显著增加了SCD酶的基因表达量(P<0.05),而6 mg·L^-1组和12mg·L^-1组虽然增加了SCD酶的基因表达量,但与对照组相比差异不显著(P>0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有增加乳腺上皮细胞中ACACA基因表达量的趋势,但与对照组相比差异不显著(P>0.05),且随着添加剂量的增加,有下降趋势;添加黄花蒿乙醇提取物可以增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量,呈剂量依赖型增加,且12mg·L^-1组可以显著增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量(P<0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有降低乳腺上皮细胞中LPL基因表达量的趋势,呈剂量依赖型降低,且6 mg·L^-1组和12mg·L^-1组显著降低了乳腺上皮细胞中LPL基因表达量(P<0.05)。【结论】黄花蒿乙醇提取物可以增加奶牛乳腺上皮细胞中SCD、ACACA和FASN酶基因的表达,有利于调控CLA和乳脂肪的生成。

奶牛乳腺细胞CXCR1基因在三种菌落刺激下的表达变化研究

本研究旨在探索在不同菌落刺激下奶牛乳腺上皮细胞中CXCR1基因的表达变化。运用SYBR Green实时荧光定量PCR技术对CXCR1基因mRNA水平进行测定。结果发现CXCR1基因在细胞水平上对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌刺激较敏感,各个时段表达差异达显示水平。本研究为今后进一步研究CXCR1基因的表达机理以及奶牛乳房炎的防治奠定了基础。

奶牛乳腺细胞IL8基因在三种菌落刺激下的表达变化研究

[目的]研究IL8基因在不同菌落刺激下在奶牛乳腺细胞中的表达变化。[方法]本试验运用SYBR Green实时荧光定量PCR技术进行定量测定。[结果]IL8基因的mRNA水平在E.coli,Streptoc.刺激下表达差异达显示水平,而在S.aureus刺激下无明显变化。[结论]IL8基因在细胞水平上对E.coli,Streptoc.刺激较敏感,为以后进一步研究IL8基因的表达机理奠定基础。

大肠杆菌感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制研究

旨在探究大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制。本试验以奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺为研究对象,按试验要求分别随机分成3组:空白对照(Control)组、大肠杆菌(E.coli)组和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组。Control组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺未被E.coli感染;E.coli组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺被感染复数为5或106 CFU的E.coli感染6或24 h,LPS组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺经1μg·mL^(-1)或20 mg·kg^(-1)体重LPS处理6或24 h,奶牛乳腺上皮细胞每组3个重复,小鼠乳腺每组6只小鼠。结果表明:1)奶牛乳腺上皮细胞胞浆中角18蛋白被染成绿色且均匀分布在细胞浆内,细胞核被DAPI染成蓝色。2)正常培养的奶牛乳腺上皮细胞内线粒体结构完整,细胞连接紧密;经E.coli感染的奶牛乳腺上皮细胞细胞间隙增大,线粒体肿胀,线粒体嵴缺失且部分模糊消失。3)E.coli感染或LPS处理使小鼠乳腺腺泡内出现中性粒细胞,且使奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢(D(520 nm)吸光值、ATP的含量、线粒体电子传递链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性降低)、线粒体的融合与分裂(Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn 2和OPA 1 mRNA表达减少)和线粒体的生物发生(PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表达下降)极显著降低(P<0.05,P<0.01)。上述研究表明,E.coli感染主要通过LPS造成奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢紊乱、抑制线粒体分裂与融合以及减少线粒体的生物发生,进而造成线粒体损伤,最终导致乳腺炎的发生。因此,确认E.coli感染是通过诱导线粒体损伤造成奶牛乳腺炎,且线粒体损伤可能是造成乳腺损伤的重要原因之一。

乙酰乙酸通过抑制Nrf2诱导奶牛乳腺上皮细胞线粒体损伤

为探究乙酰乙酸(Acetoacetic acid,ACAC)是否通过抑制核转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor E2-reate d factor2,Nrf2)导致奶牛乳腺上皮细胞线粒体损伤。在奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T)中添加0、0.6、1.2或1.8 mmol·L-1ACAC处理24 h;用10μmol·L-1的萝卜硫素(Sulforaphane,SFN)预处理MAC-T 24 h后,加入1.2 mmol·L-1ACAC处理24 h。流式细胞术检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS);采用JC-1染色检测线粒体膜电位变化情况;通过q-PCR测定线粒体氧化磷酸化复合物Ⅰ-Ⅴ(Oxidative phosphorylation complexesⅠ-Ⅴ,COⅠ-Ⅴ)的基因表达情况以及线粒体生物合成调节因子Nrf2、过氧化物酶体增殖体激活受体γ-γ活化剂1-α(Peroxlsome proliferator-activated re ceptor-γ coac tlvator-1α,PGC-1α)、线粒体转录因子A (Mitoc hondrial transcription factor A,TFA M)、核呼吸因子-1 (Nuclear respiratory fac tor-1,Nrf1)、线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mt DNA);使用试剂盒检测腺嘌呤核苷三磷酸(A denosine triphosphate,ATP)含量。结果显示,ACAC处理后,ROS的含量显著升高(P<0.05),而线粒体膜电位显著下降(P<0.05),并且COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的m RNA表达水平显著降低(P<0.05),PGC-1α、TFAM、Nrf1以及Nrf2的m RNA表达量显著下降(P<0.05),mtDNA含量显著降低(P<0.05),ATP含量显著降低(P<0.05),而SFN预处理缓解了上述影响。结果表明,ACAC通过抑制Nrf2信号通路诱导了MAC-T细胞线粒体损伤。

脂噬对奶牛乳腺上皮细胞脂滴大小的调控研究

脂噬是一种新的自噬形式,可以选择性识别脂滴并将其降解,在维持细胞内脂质稳态等过程中发挥着重要的作用。本研究旨在探讨奶牛乳腺上皮细胞经饥饿诱导脂噬后对细胞脂滴大小的调控作用。试验用100μmol·L^(-1)的亚油酸处理细胞24 h,刺激细胞脂滴蓄积,然后分别饥饿诱导细胞0、6、12、24、48 h,油红O染色观察细胞内脂滴的尺寸和数量随饥饿时间的变化情况,随后饥饿诱导24 h通过免疫荧光观察脂滴和自噬蛋白LC3的共定位,蛋白免疫印迹检测细胞内自噬蛋白LC3和P62的表达,透射电镜观察脂滴自噬情况。结果发现:随着饥饿处理时间的延长,脂滴直径从1.57μm显著增加到2.12μm,每个细胞的脂滴数量显著减少,从39个·cell^(-1)减少到24个·cell^(-1),大脂滴比例显著增加,小脂滴比例显著减少(P<0.05),免疫荧光发现LC3与脂滴发生共定位,透射电镜观察发现自噬溶酶体包裹着脂滴,饥饿处理24 h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的比值显著增加1倍,P62蛋白表达显著下降(P<0.05)。以上结果表明,脂噬对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的大小发挥调控作用。

GPR37L1对奶牛乳腺上皮细胞乳成分合成相关基因表达的影响

运用分子生物学技术构建GPR37L1表达和干扰载体,以奶牛乳腺上皮细胞为试验模型,通过瞬时转染技术构建载体转染乳腺上皮细胞,探究GPR37L1对乳成分合成相关基因表达的影响。结果表明,GPR37L1表达和干扰载体构建成功,GPR37L1过表达或干扰可提高或降低乳脂合成相关基因及β-酪蛋白表达,揭示GPR37L1可正向调节乳成分合成。

RANKL对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的作用研究

文章研究利用LPS诱导建立奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,过表达RANKL后,采用MTT法检测奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中奶牛乳腺上皮细胞活力,采用荧光定量PCR技术检测奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中炎症因子IL1β、IL6、i NOS、TNF-α的m RNA表达,探讨RANKL对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的作用。结果表明,以10μg/mL LPS处理奶牛乳腺上皮细胞24 h建立奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,RANKL可显著提高奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中奶牛乳腺上皮细胞活力,降低奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中IL1β、IL6、i NOS的mRNA表达,同时显著降低奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中TNF-α的mRNA及蛋白表达。

miR-223对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的影响

以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞(dairy cow mammary epithelial cell,DCMECs)为研究模型,探讨mi R-223对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的DCMECs炎症反应与乳脂合成的影响。应用Western blot检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)与脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)的表达情况,通过脂质体转染技术将mi R-223转染至DCMECs,qRT-PCR检测mi R-223的相对表达量,采用原位荧光技术分别检测DCMECs的凋亡与乳脂合成能力。结果表明LPS诱导DCMECs炎症反应的最佳浓度为1μg/m L;添加LPS可促进DCMECs mi R-223的表达;DCMECs转染mi R-223后,mi R-223的表达显著上调;mi R-223可下调LPS诱导的DCMECs炎症蛋白因子TNF-α,上调乳脂合成相关蛋白FASN,抑制LPS诱导的细胞凋亡,促进LPS诱导的乳脂合成。

基于沉默信息调节因子1/p65通路探讨竹叶黄酮对过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞焦亡的保护作用机制

本试验旨在通过过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)焦亡模型探讨竹叶黄酮(BLF)预处理缓解bMECs焦亡的作用机制。试验以bMECs为研究对象,设对照组、BLF组、H_(2)O_(2)组、BLF+H_(2)O_(2)组、BAY 11-7082+H_(2)O_(2)组、BLF+BAY 11-7082+H_(2)O_(2)组、EX 527+H_(2)O_(2)组和BLF+EX 527+H_(2)O_(2)组,BLF作用浓度为80μg/mL,H_(2)O_(2)作用浓度为800μmol/L,使用BAY 11-7082和EX 527干预p65和沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达。利用PCR和Western Blot技术检测细胞内焦亡相关基因和蛋白的表达水平,利用流式细胞术检测焦亡细胞数量,并利用免疫荧光技术检测细胞内凋亡相关斑点样蛋白(ASC)斑点的荧光强度,以观测SIRT1/p65通路在BLF缓解H_(2)O_(2)诱导的bMECs焦亡中发挥的作用。结果显示:1)H_(2)O_(2)诱导的bMECs焦亡中p 65的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),BLF处理后p 65的mRNA和蛋白表达水平则显著降低(P<0.05);BLF与BAY 11-7082对p65表达及核转位的抑制效果显著(P<0.05),可有效缓解bMECs焦亡,同时二者也显著降低了bMECs焦亡相关基因和蛋白的表达水平(P<0.05),并增强了ASC斑点的荧光强度。2)H_(2)O_(2)诱导的bMECs焦亡中SIRT1的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),BLF处理后SIRT1的mRNA和蛋白表达水平则显著升高(P<0.05);EX 527对抑制SIRT1、促进p65的表达及核转位的效果显著(P<0.05);EX 527也显著升高了bMECs焦亡相关基因和蛋白的表达水平(P<0.05),并增强了ASC斑点的荧光强度。综上所述,80μg/mL的BLF通过抑制p65的表达和核转位,缓解H_(2)O_(2)诱导的bMECs焦亡和NLRP3炎症小体激活;SIRT1的表达在H_(2)O_(2)诱导的bMECs焦亡中被下调,BLF缓解H_(2)O_(2)诱导的bMECs焦亡是通过上调SIRT1的表达来抑制p65的表达来实现的。

槲皮素抑制自噬恢复LTA诱导的奶牛乳腺上皮细胞紧密连接功能

旨在探究槲皮素(quercetin)修复脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(mammary alveolar cells-large T antigen,MAC-T)紧密连接损伤的作用机制。本试验以MAC-T为研究对象,设置不同浓度的LTA组(0、0.1、1、10μg·mL^(-1))、不同浓度的槲皮素组(0、5、10、20μmol·L^(-1))、空白组,检测不同浓度LTA和槲皮素对MAC-T细胞活力的影响。设置对照组(不做任何处理)、低、中、高浓度LTA组(0.1、1、10μg·mL^(-1)),筛选LTA最佳作用浓度;设置对照组(不做任何处理)、高浓度LTA+低浓度槲皮素(5μmol·L^(-1))、高浓度LTA+中浓度槲皮素组(10μmol·L^(-1))、高浓度LTA+高浓度槲皮素组(20μmol·L^(-1)),筛选槲皮素最佳作用浓度。在自噬与紧密连接关系的研究中,将细胞分为对照组(不做任何处理)、高浓度LTA组、高浓度LTA+中浓度槲皮素组、高浓度LTA+自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)组(50μmol·L^(-1))。每组均进行3次重复,槲皮素与氯喹均在LTA作用前加入,即使用槲皮素和氯喹分别孵育细胞3 h后,再加入10μg·mL^(-1)LTA继续培养12 h,通过CCK-8法检测不同浓度LTA和槲皮素对MAC-T活力的影响,利用Western blot和免疫荧光检测细胞紧密连接蛋白(Occludin、ZO-1、Claudin-1)和自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62)的表达水平。结果显示,中、高浓度LTA对MAC-T活力有显著影响,但细胞活性维持在90%以上,不同浓度槲皮素对MAC-T活力均无显著影响。此外,LTA诱导后的MAC-T中紧密连接蛋白表达降低,自噬水平升高;槲皮素作用MAC-T后,细胞紧密连接蛋白表达升高,自噬水平降低;自噬抑制剂CQ作用后,自噬水平被抑制,紧密连接蛋白表达升高。LTA可导致MAC-T自噬过度激活,破坏紧密连接功能,而槲皮素可通过抑制自噬恢复紧密连接功能。该研究结果为奶牛乳腺炎的治疗提供了新的研究思路和理论依据。

BLV-ΔmiRNAs和BLV感染奶牛乳腺上皮细胞的基因转录组学分析

地方流行性牛白血病(enzootic bovine leukosis,EBL)是由牛白血病病毒(bovine leukemia virus,BLV)感染所引起的一种肿瘤增生性疾病,在我国奶牛群中广泛流行,制约着我国奶牛养殖行业的发展。BLV一般通过子宫内感染及摄入受感染的牛奶和初乳发生感染,感染后的奶牛乳腺上皮细胞对金黄色葡萄球菌更易感。作为BLV高效复制所必需的功能元件,BLV-miRNAs在肿瘤形成的过程中起着关键的作用,但BLV-miRNAs对奶牛乳腺组织的影响缺乏报道。研究使用BLV和BLV-ΔmiRNAs 2种病毒分别感染奶牛乳腺上皮细胞,进行UMI绝对定量转录组测序。结果显示:BLV和BLV-ΔmiRNAs 2种病毒感染奶牛乳腺上皮细胞后,基因转录水平发生变化,差异基因主要富集在生物进程中,包括基因转录(HMGA1、C1QBP、PTMA等)、细胞衰老(HMGA1、SERP1等)、细胞增殖迁移(PTPRJ、EPPK1等)、病毒感染复制(HMGA1、C1QBP等)、蛋白质代谢(SERP1、USE1等)、免疫功能(PTMA、PTPRJ等),KEGG分析结果显示BLV-miRNAs可以激活代谢通路、miRNA与癌症、病毒感染、病毒致癌、IL-17信号通路、粘附连接等信号通路。因此,BLV-miRNAs在BLV感染奶牛乳腺组织时可能通过影响乳腺上皮细胞免疫功能,改变细胞状态,从而加快病毒感染进程,促进病原菌的侵染,加快奶牛乳腺疾病的发生发展。试验结果为进一步研究BLVmiRNAs的功能研究奠定了基础。

GPR120的激活与抑制对LTA诱导奶牛乳腺上皮细胞相关促炎基因表达及细胞活力的影响

为探讨GPR120基因对LTA介导的奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应的缓解作用,试验使用GPR120激活剂TUG891与抑制剂AH7614处理Mac-T细胞,选用20μg·m L^(-1)的LTA刺激Mac-T细胞构,建奶牛乳腺炎症细胞模型;通过q RT-PCR、Western blot与CCK-8法检测各组GPR120的表达水平及激活与抑制GPR120后在LTA诱导的Mac-T细胞炎症应答过程中,细胞内相关促炎因子的m RNA表达变化及对细胞活力的影响。结果表明:使用GPR120激活剂与抑制剂处理细胞3 h,GPR120的m RNA表达水平均达到极显著上调与抑制(P<0.01);使用20μg·m L^(-1)LTA刺激Mac-T细胞24 h后,检测促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA表达水平均明显上调(P<0.05),表明基于使用LTA构建的奶牛乳房炎的Mac-T细胞模型成功,且LTA刺激显著促进GPR120的表达水平(P<0.05);激活GPR120可显著缓解由LTA诱导的炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放(P<0.05);而抑制GPR120可进一步显著加剧由LTA诱导的Mac-T细胞产生的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的高表达(P<0.01),蛋白表达水平结果与上述一致。用LTA刺激Mac-T细胞后48 h内,细胞活力显著下降(P<0.01);而使用激活剂处理后可显著缓解由LTA诱导引发细胞活力的降低(P<0.01),使用抑制剂处理后进一步引发细胞活力降低。由此可见,GPR120参与了LTA诱导的牛乳腺上皮细胞的炎症反应,并且GPR120的激活减缓了炎症反应,这一研究结果可为筛选奶牛乳房炎抗性基因提供重要依据。

竹叶黄酮通过调节抗氧化通路和自噬缓解奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的作用机制

本试验旨在探究竹叶黄酮(BLF)对氧化应激的奶牛乳腺上皮细胞自噬和抗氧化通路的影响,并通过添加自噬抑制剂Mdivi-1探究自噬与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的关联性。以奶牛乳腺上皮细胞MAC-T细胞系为研究对象,将维持培养基中处理的MAC-T设为对照组,经含BLF(80μg/mL)的维持培养基处理的MAC-T设为BLF组,经含过氧化氢(H_(2)O_(2),800μmol/L)的维持培养基处理的MAC-T设为H_(2)O_(2)组(诱导氧化应激),经含BLF(80μg/mL)的维持培养基和含H_(2)O_(2)(800μmol/L)的维持培养基处理的MAC-T设为BLF+H_(2)O_(2)组,经含BLF(80μg/mL)的维持培养基、含Mdivi-1(1μmol/L)的维持培养基以及含H_(2)O_(2)(800μmol/L)的维持培养基处理的MAC-T设为BLF+H_(2)O_(2)+Midiv组,经含Mdivi-1(1μmol/L)的维持培养基处理的MAC-T设为Midiv组。培养结束后,采用实时荧光定量PCR检测自噬和Keap1-Nrf2信号通路相关基因的相对表达量,免疫印迹法检测自噬及Keap1-Nrf2、胞外信号调节激酶(MAPK)信号通路相关蛋白的表达量,免疫荧光技术检测转录因子EB(TFEB)、Nrf2蛋白表达及核移位情况。结果显示:1)BLF预处理能显著增加氧化损伤细胞中自噬标志物Beclin1、Parkin蛋白的表达量(P<0.05),显著增加溶酶体功能相关蛋白组织蛋白酶D(CTSD)和溶酶体关联膜蛋白1(LAMP1)蛋白的表达量(P<0.05),显著增加腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)蛋白的磷酸化程度和TFEB蛋白的表达量(P<0.05),并促进TFEB核转位,显著升高溶酶体相关基因囊泡型ATP酶H亚基(ATP6V1H)、组织蛋白酶B(CTSB)、三肽基肽酶1(TPP1)和自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(LC3)的相对表达量(P<0.05)。2)BLF预处理能显著减少氧化损伤细胞中Keap1蛋白的表达量(P<0.05),导致Nrf2蛋白在细胞质内稳定并大量转移到细胞核内,激活下游Nrf2靶基因血红素加氧酶-1(HO-1)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)的转录与翻译。但是,通过Mdivi-1抑制自噬将抑制BLF对Keap1-Nrf2信号通路的促进作用。综上所述,本研究发现BLF通过促进细胞自噬和溶酶体功能,激活Keap1-Nrf2信号通路来缓解奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激,并且自噬与抗氧化信号通路之间存在相互串扰。

白藜芦醇缓解脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤和细胞凋亡

本试验旨在研究白藜芦醇(RES)对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎性损伤和细胞凋亡的影响。试验采用LPS诱导构建炎性损伤bMECs模型,采用单因子随机试验设计方法,构建对照组(CON组,用饥饿培养基孵育bMECs 24 h)、LPS组(用含10μg/mL LPS配制的饥饿培养基孵育bMECs 24 h)、RES组(用含15μmol/L RES配制的饥饿培养基孵育bMECs 24 h)和RES+LPS组(用含10μg/mL LPS+15μmol/L RES共同配制的饥饿培养基孵育bMECs 24 h)。结果表明:1)与0μg/mL LPS相比,10μg/mL的LPS处理bMECs 24 h显著或极显著降低细胞活力和bMECs中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子2(Nrf2)和线粒体转录因子A(TFAM)的mRNA相对表达水平(P<0.05或P<0.01),极显著提高了bMECs中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和丙二醛(MDA)的mRNA相对表达水平(P <0.01),表明bMECs炎性损伤模型构建成功。RES缓解炎性损伤bMECs的适宜浓度为15μmol/L。2)与CON组相比,LPS组的bMECs中IL-8、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、MDA、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA相对表达水平显著或极显著提高(P<0.05或P<0.01),PGC-1α、TFAM和B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的mRNA相对表达水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01);与LPS组相比,RES+LPS组的bMECs中IL-8、TNF-α、MDA和Bax的mRNA相对表达水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),PGC-1α、TFAM和Bcl-2的mRNA相对表达水平极显著升高(P<0.01)。由此可见,外源添加RES可起到缓解LPS诱导的bMECs线粒体损伤、氧化应激、炎性反应和细胞凋亡,为在奶牛生产中推广应用RES奠定了技术支撑。

竹叶黄酮对奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的缓解作用及对乳脂合成的影响

本试验旨在探究竹叶黄酮(BLF)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)氧化损伤的缓解作用及对乳脂合成的影响。以BMECs为研究对象,进行如下操作:对照组1是将细胞接种于不添加任何物质的维持培养基中培养24 h;损伤组是将细胞接种于含800μmol/L过氧化氢(H_(2)O_(2))的维持培养基中处理8 h;对照组2是将细胞接种于含80μg/mL BLF的维持培养基中培养24 h;保护组是将细胞接种于含80μg/mL BLF的维持培养基中培养24 h后,更换含800μmol/L H_(2)O_(2)的维持培养基中继续处理8 h。应用试剂盒检测细胞内抗氧化指标,实时荧光定量PCR方法检测细胞内抗氧化、凋亡和乳脂合成相关基因的mRNA相对表达量,免疫印迹法检测乳脂合成相关蛋白的表达量。结果显示:1)与损伤组相比,保护组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05)。2)与对照组1相比,损伤组细胞内活性氧(ROS)含量显著提升(P<0.05),BLF预处理可以显著抑制受氧化损伤的细胞内ROS产生(P<0.05)。3)与损伤组相比,保护组细胞内凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),抗凋亡基因B淋巴细胞瘤2(Bcl2)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),抗氧化基因血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和核转录因子E2相关因子2(Nrf2)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。4)与对照组1相比,损伤组细胞内脂滴(LDs)含量减少,保护组细胞内LDs含量有所增加;保护组细胞内甘油三酯(TGs)含量虽未恢复到正常水平,但与损伤组相比差异显著(P<0.05)。5)与损伤组相比,保护组细胞内乳脂合成相关基因乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)、乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂肪酸合成酶(FASN)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的mRNA相对表达量均显著升高(P<0.05)。6)与对照组1相比,保护组细胞内乳脂合成相关蛋白ACSS2、FABP3、PPARγ和SCD的相对表达量均显著上升(P<0.05)。综上所述,BLF不仅能通过提升Nrf2及其下游抗氧化基因的表达,从而提升氧化损伤的BMECs的抗氧化能力,降低氧化应激带来的氧化损伤,而且BLF还能够有效提升乳脂相关基因和蛋白的表达,从而促进乳脂合成,有效减少氧化损伤对机体乳脂合成的影响。

白藜芦醇激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α缓解脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤和细胞凋亡

为揭示白藜芦醇(RES)是否通过介导过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)起到缓解奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎性反应,本试验对PGC-lα进行干扰(si-PGC-lα),采用单因素随机试验设计方法,设置si-NC+LPS组(含10μg/mL LPS配制的饥饿培养基)、si-PGC-lα+LPS组(si-PGC-lα干扰片段+含10μg/mL LPS配制的饥饿培养基)、si-NC+RES+LPS组(含10μg/mL LPS以及15μmol/L RES共同配制的饥饿培养基)、si-PGC-lα+RES+LPS组(si-PGC-lα干扰片段+10μg/mL LPS以及15μmol/L RES共同配制的饥饿培养基)。结果发现:si-PGC-lα后加入LPS可显著或极显著上调炎性因子白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的mRNA相对表达水平和含量(P<0.05或P<0.01),极显著上调氧化因子丙二醛(MDA)的mRNA相对表达水平(P<0.01),显著或极显著上调促凋亡因子B-细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(BAX)的mRNA相对表达水平和bMECs凋亡率(P<0.05或P<0.01),极显著降低抗氧化基因谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的mRNA相对表达水平(P<0.01);而RES可逆转这一反应。当si-PGC-lα后再用RES处理则无法缓解LPS诱导的bMECs产生的氧化应激、炎性反应和细胞凋亡,说明RES是通过激活PGC-1α起到缓解LPS诱导的bMECs炎性损伤和细胞凋亡。由此可见,外源添加RES可通过激活PGC-1α起到缓解LPS诱导的bMECs线粒体损伤、氧化应激、炎性反应并抑制细胞凋亡。

表没食子儿茶素没食子酸酯对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤和凋亡的干预作用

【目的】探究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)炎症和凋亡的影响及其潜在的保护机制。【方法】利用LPS诱导BMECs构建细胞炎症模型。通过CCK-8检测细胞活力,筛选EGCG最佳浓度。将BMECs分为对照组、LPS处理组和EGCG+LPS共处理组,利用实时荧光定量PCR检测细胞中炎性因子、凋亡因子以及抗氧化相关基因mRNA表达水平;利用试剂盒检测BMECs的线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平;通过流式细胞术检测BMECs凋亡情况。【结果】使用LPS处理BMECs后,与0 h相比,各时间段细胞中炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-8和IL-1β基因mRNA表达量均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),成功构建BMECs细胞炎性损伤模型。CCK-8检测细胞活力结果显示,EGCG最佳作用浓度为5μmol/L。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,LPS诱导的BMECs中IL-6、IL-8、丙二醛(MDA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)基因mRNA表达量均极显著升高(P<0.01),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、B细胞淋巴瘤蛋白-2(Bcl-2)基因mRNA表达量极显著降低(P<0.01);与LPS组相比,EGCG+LPS组细胞中IL-6、IL-8、IL-1β、MDA、Bax和Caspase-3基因mRNA表达量均显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01),GSH-Px、超氧化物歧化酶(SOD)、Bcl-2基因mRNA表达量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。线粒体膜电位检测结果显示,与对照组相比,LPS组BMECs红色荧光明显减弱,绿色荧光有所增强,而EGCG和LPS共孵育后则对BMECs红色荧光没有明显影响,绿色荧光相对减弱;ROS水平检测结果显示,与对照组相比,LPS组细胞绿色荧光明显增强,而EGCG和LPS共孵育后,细胞绿色荧光有所减弱。流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,LPS处理后死亡细胞和凋亡细胞明显增多,细胞凋亡率极显著升高(P<0.01),而EGCG和LPS共孵育后凋亡细胞则明显减少,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。【结论】EGCG可以通过抑制LPS诱导BMECs中ROS释放和缓解线粒体损伤等综合作用,缓解炎性反应并抑制细胞凋亡,研究结果为EGCG预防和治疗奶牛乳腺炎提供理论基础。