TNF-α对体外培养奶牛乳腺成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达的影响

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα,TNF-α）主要来源于活化的巨噬细胞、肥大细胞和T细胞等,参与炎症反应和免疫调节过程,并能够刺激成纤维细胞的增殖过程。TNF-α通过与细胞的肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）结合发挥作用,TNFR一般分为TNFR1（CD120a）和TNFR2（CD120b）两型。TNFR1分布于多种正常细胞或肿瘤细胞表面,TNFR1被认为是TNF-α的主要受体。

金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路及其转分化的影响

为探索金黄色葡萄球菌(S.aureus)对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1/Smad信号通路及其转分化的影响,用热灭活金黄色葡萄球菌(0、10~4、10~5、10~6、10~7和10~8 CFU·mL^(-1))刺激BMFB,24h后采用Real-time PCR方法检测TGF-β1、α-SMA和collagen-ⅠmRNA的转录量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3蛋白的表达量。使用TGF-β1受体特异性抑制剂SB-431542预处理细胞,再用10~5 CFU·mL^(-1)热灭活金黄色葡萄球菌刺激细胞,24h后采用Real-time PCR方法检测α-SMA和collagen-ⅠmRNA的转录量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3蛋白的表达量,免疫荧光法检测collagen-Ⅰ蛋白的表达量。结果显示,不同浓度热灭活金黄色葡萄球菌处理细胞的TGF-β1mRNA的转录量显著升高(P<0.05或P<0.01),其中以10~5CFU·mL^(-1)刺激组的TGF-β1mRNA的转录量最高。不同浓度灭活的金黄色葡萄球菌处理细胞的α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表达量均能显著升高(P<0.05或P<0.01),其中以10~5 CFU·mL^(-1)刺激组的α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表达量最高。抑制剂SB-431542能够极显著抑制α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表达量(P<0.01)。结果提示,金黄色葡萄球菌能够通过TGF-β1/Smad信号通路诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,本研究为揭示金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生硬化的机制奠定基础。

奶牛乳腺成纤维细胞中Toll样受体与NOD样受体及其信号通路相关分子mRNA的检测

先天性免疫应答中,由模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）识别病原微生物的病原体相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMP）,如脂多糖（liposachride,LPS）、肽聚糖（peptidoglycan,PGN）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid）等。Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）是典型的PRR，主要分布于免疫细胞的细胞膜表面。

无乳链球菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞瘦素及其受体表达的影响

为研究无乳链球菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)瘦素(Leptin)及其长型受体(OB-Rb)表达的影响,本研究将不同浓度热灭活的无乳链球菌(0、10~5 cfu/mL、10~6 cfu/mL和10~8 cfu/mL)作用于BMFB,分别于不同作用时间采用荧光定量PCR(qPCR)方法检测Leptin及OB-Rb mRNA转录水平,western blot方法检测Leptin及OB-Rb蛋白的表达。各组总体变化规律结果显示,无乳链球菌作用BMFB后,除6 h、12 h 10~6 cfu/m L和10~8 cfu/mL作用浓度外,其余作用时间实验组Leptin mRNA的转录水平及蛋白表达量与对照组相比显著升高(p<0.05);各作用时间实验组OB-Rb mRNA的转录水平及蛋白表达量与对照组相比极显著升高(p<0.01)。上述研究结果表明,热灭活的无乳链球菌能够促进BMFB的Leptin及OB-Rb mRNA的转录水平和蛋白的表达,为奶牛乳腺纤维化的防治提供依据。

热灭活无乳链球菌对奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β_1及其受体表达的影响

研究无乳链球菌(GBS)对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)转化生长因子β_1(TGF-β_1)及其受体TβRⅠ表达的影响。6代和7代BMFB,在6、12、24、48h时间点,分别用无血清培养液和10~5、10~6、10~8CFU/mL的不同浓度的热灭活GBS作用于BMFB细胞。RT-qPCR法检测TGF-β_1及TβRⅠmRNA的表达,Western blot法检测TGF-β_1和TβRⅠ蛋白的表达。与对照组相比,TGF-β_1mRNA的表达量明显升高,于24h达到最大值(P<0.05);TGF-β_1蛋白的表达于12h达到最大值,24h蛋白表达量开始明显降低(P<0.05)。TβRⅠmRNA的表达量较对照组的升高,在48h达到峰值(P<0.05);TβRⅠ蛋白表达量在12h低于6h,24h达到峰值,之后又下降(P<0.05)。说明热灭活无乳链球菌对BMFB TGF-β_1及TβRⅠmRNA和蛋白的表达有促进作用。

大肠杆菌诱导奶牛乳腺成纤维细胞MMP-2、MMP-9和uPA系统表达的研究

通过研究大肠杆菌(E.coli)作用奶牛乳腺成纤维细胞(BMFBs)后对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9和uPA系统(uPA/uPAR/PAI-1)表达的影响,以进一步阐明MMPs和uPA系统在调控细胞外基质(ECM)代谢中的作用。本研究从患乳腺炎的奶牛乳腺中分离E.coli,制成热灭活的E.coli菌液,采用不同浓度的热灭活E.coli菌液(1×10^5 cfu/mL、1×10^6 cfu/mL、1×10^8 cfu/mL)作用于BMFB,于作用后不同时间点(6 h、12 h、24 h、48 h)通过RTqPCR和western blot检测MMP-2、MMP-9、uPA、uPAR和PAI-1 mRNA的转录水平和蛋白的表达水平,采用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9的酶活性。结果显示,MMP-2和MMP-9 mRNA的转录水平与对照组相比均有不同程度的升高趋势,且显著变化趋势集中在作用后24 h(p<0.001),其中MMP-2蛋白的表达水平与对照组相比主要呈先下降后升高再下降的趋势,但在作用后12 h极显著下降(p<0.001),在作用后24 h极显著升高(p<0.001);MMP-9蛋白的表达水平与对照组相比主要呈先升高后下降再升高的趋势,在作用后6 h和48 h极显著升高(p<0.01);明胶酶谱法检测MMP-2的酶活性良好且在作用24 h活性最高,MMP-9的酶活性较弱。uPA mRNA的转录水平与对照组相比随作用时间延长均呈不同程度的升高趋势,且高浓度处理组差异显著(p<0.01),uPA的蛋白表达水平与对照组相比主要呈先升高后下降再升高的趋势,高浓度处理组在作用24 h和48 h差异显著(p<0.01);uPAR mRNA的转录水平与对照组相比随作用时间延长主要呈升高趋势,高浓度处理组作用差异显著(p<0.01),uPAR蛋白表达水平与对照组相比主要呈先升高后下降的趋势,在作用48 h极显著降低(p<0.001);PAI-1 mRNA转录水平与对照组相比随作用时间延长主要呈升高趋势,高浓度处理组在作用24 h和48 h PAI-1 mRNA转录水平均差异显著(p<0.01),PAI-1蛋白的表达水平与对照组相比主要呈先降低后升高再降低的趋势,在作用12 h和48 h均极显著降低(p<0.01),在作用24 h极显著升高(p<0.001)。研究表明,热灭活的E.coli菌液诱导BMFB中MMP-2、MMP-9和uPA系统的表达,激活uPA系统参与调控MMP-2和MMP-9的表达,进而参与降解ECM来影响奶牛乳腺纤维化过程,本研究结果为MMP-2、MMP-9和uPA系统成为治疗奶牛乳腺纤维化的靶点提供了一定的依据。

奶牛乳腺炎源性大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞瘦素及其受体表达的影响

为了研究大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)对奶牛乳腺成纤维细胞(bovine mammary fibroblast, BMFB)中瘦素(leptin, LP)、长型瘦素受体(leptin receptor, OB-Rb)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ, COL Ia1)表达的影响,以探讨大肠杆菌感染引起奶牛乳腺纤维化的分子机制,试验用不同浓度(1×10~5 cfu/mL、1×10~6 cfu/mL、1×10~8 cfu/mL)的热灭活E.coli作用于BMFB,并以无血清培养液作为对照组,同时利用qPCR及Western-blot检测LP、OB-Rb和COL Ia1 mRNA及其蛋白的表达水平并进行相关性分析。结果表明:E.coli作用BMFB后,1×10~8 cfu/mL处理组LP、OB-Rb和COL Ia1 mRNA的转录水平与对照组相比显著升高(P<0.05),1×10~8 cfu/mL处理组LP、OB-Rb和COL Ia1蛋白表达水平在24,48小时时显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)且与作用时间呈正相关。LP与OB-Rb mRNA相关性分析显示,两个因子在12小时时显著相关(P<0.05),其蛋白水平相关性分析显示,两个因子在48小时时极显著相关(P<0.01);LP与COL Ia1 mRNA在6小时时显著相关(P<0.05),其蛋白在24,48小时时极显著相关(P<0.01);OB-Rb与COL Ia1 mRNA在24,72小时时极显著相关(P<0.01),其蛋白在6小时时显著相关(P<0.05)。说明1×10~8 cfu/mL热灭活的E.coli能够促进BMFB中LP、OB-Rb和COL Ia1 mRNA的转录和蛋白表达。

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1和NF-κB及TLR4表达的影响

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用于奶牛乳腺成纤维细胞,分别于不同时间点(作用后第6、12、24、48小时)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和TLR4mRNA的表达,运用Western-blot检测TGF-β1、TLR4和p-NF-κB-p65蛋白的相对表达量。结果显示,大肠杆菌作用BMFB后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达量显著的升高,并且TGF-β1mRNA的表达呈明显的时效及量效关系,于第24小时达到高峰后降低(P<0.05);TGF-β1蛋白的表达量呈量效性(P<0.05)。TLR4mRNA和蛋白表达水平显著升高,并且TLR4mRNA和蛋白的表达呈时效性和量效性,分别于作用后第24和12小时达到最高后逐渐下降(P<0.05)。p-NF-κB-p65的表达与大肠杆菌作用浓度呈正量效关系,表达量随作用时间延长先升高后逐渐降低(P<0.05)。上述研究结果表明,热灭活的大肠杆菌能够促进BMFB的TLR4表达,并激活BMFB p-NF-κB-p65蛋白的表达,从而促进TGF-β1的表达。

金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺成纤维细胞α-SMA及collagen-Ⅰ表达的影响

为研究金黄色葡萄球菌(S.aureus)对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)α-SMA及collagen-Ⅰ表达的影响,本研究分别用不同浓度的热灭活金黄色葡萄球菌(0,10~4,10~5,10~6,10~7和10~8 CFU/mL)刺激BMFB,24h后采用Real timePCR方法、Western blot方法及免疫荧光法检测α-SMA及collagen-ⅠmRNA和蛋白的表达量。结果显示,不同浓度灭活的金黄色葡萄球菌处理细胞的α-SMA及collagen-Ⅰ均能显著升高(P<0.05),其中以10~5 CFU/mL刺激组的α-SMA及collagen-Ⅰ的mRNA和蛋白的表达量最高。结果表明,金黄色葡萄球菌可以使奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,为揭示金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生硬化的机理提供数据。

金黄色葡萄球菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞PDGF-BB及其受体PDGFRβ表达的影响

为研究不同浓度的金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)血小板源性细胞生长因子(PDGF-BB)及其受体PDGFRβ表达的影响,采用不同浓度的热灭活金黄色葡萄球菌(0、105、106和108 CFU/mL)作用于BMFB细胞,分别于不同的时间点(6、12、24和48h)采用RT-PCR法检测PDGF-BB及PDGFRβmRNA表达,Western-blot法检测PDGF-BB及PDGFRβ蛋白的表达。结果显示,金黄色葡萄球菌作用于BMFB后,PDGF-BB mRNA表达量的升高呈明显的时效关系和量效关系(P<0.05);PDGF-BB蛋白表达升高呈明显的时效关系(P<0.05)。PDGFRβmRNA的表达量较对照组升高,呈正量效关系和正时效关系,在12h达到峰值后下降,同时mRNA表达量呈负量效关系(P<0.05);PDGFRβ蛋白表达量呈正时效关系(P<0.05)。本研究证实了金黄色葡萄球菌可以上调BMFB PDGF-BB及PDGFRβmRNA和蛋白的表达。

NF-κB信号通路在金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化中的作用

用热灭活金黄色葡萄球菌(0,104,105,106,107和108 CFU/mL)刺激奶牛乳腺成纤维细胞,24h后采用Real time-PCR方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1mRNA的表达量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-I及pNF-κB p65蛋白的表达量。使用NF-κB通路抑制剂PDTC预处理细胞,再用105 CFU/mL热灭活金黄色葡萄球菌刺激细胞,24h后采用Real time-PCR方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1 mRNA的表达量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-I及p-NF-κB p65蛋白的表达量,免疫荧光法检测α-SMA及collagen-I蛋白的表达量。结果显示,不同浓度热灭活金黄色葡萄球菌处理细胞的TGF-β1mRNA的表达量显著升高(P<0.05),其中以105 CFU/mL刺激组的TGF-β1mRNA的表达量最高。随着热灭活金黄色葡萄球菌浓度的升高,p-NF-κB p65蛋白的表达量逐渐升高(P<0.01),TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表达量也逐渐升高(P<0.01)。不同浓度灭活的金黄色葡萄球菌处理细胞的α-SMA及collagen-I蛋白的表达量均能显著升高(P<0.05),其中以105 CFU/mL刺激组的α-SMA及collagen-I蛋白的表达量最高。抑制剂PDTC能够显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1 mRNA的表达量(P<0.05),PDTC能够显著抑制α-SMA、collagen-I及p-NF-κB p65蛋白的表达量(P<0.05)。结果提示,NF-κB信号通路在金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞过程中发挥重要作用,本研究为揭示金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生硬化的机制奠定基础。

脂多糖对奶牛乳腺成纤维细胞增殖速率、胞内Toll样受体及其信号通路相关基因mRNA表达水平的影响

目的探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对奶牛乳腺成纤维细胞(bovine mammary fibroblast,BMFB)增殖速率、胞内Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)及其信号通路相关基因m RNA表达水平的影响。方法原代培养BMFB,用LPS(终浓度10μg/mL)刺激BMFB不同时间后,经CCK-8法检测BMFB的增殖速率,实时荧光定量PCR法检测BMFB胞内TLR及其信号通路相关分子m RNA的表达水平。结果 LPS刺激BMFB 0、1、3 h后,BMFB增殖速率差异无统计学意义(P>0.05),LPS刺激BMFB 6 h开始,试验组BMFB的增殖速率明显快于对照组(P<0.05)。与对照组比较,LPS刺激BMFB 12 h后,TLR2、TLR4、信号转导通路激活核转录因子κB(nuclear factor of kappa B,NF-κB)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha-α,TNF-α)和白细胞介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor associated kinase 1,IRAK1)基因m RNA表达水平显著升高(P<0.05),髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)基因m RNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMFB可能通过TLR2和TLR4识别LPS,并与NF-κB信号通路级联诱导炎性细胞因子和趋化因子的释放,参与奶牛乳腺先天性免疫应答。

病原体相关分子模式(PAMP)诱导对奶牛乳腺成纤维细胞TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表达的影响

通过观察病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)诱导对奶牛乳腺成纤维细胞(bovine mammary fibroblast,BMFB)TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA表达的影响,揭示BMFB的免疫应答功能。本试验以BMFB为研究对象,分别用100 mg/L lipid A和10 mg/L胞壁酰二肽(MDP)诱导24 h,采用半定量RT-PCR检测细胞中TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA表达的情况。结果显示,BMFB可表达TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA;与对照组相比,lipid A组TLR4、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表达水平显著上调(P<0.05);胞壁酰二肽(MDP)组NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表达水平显著上调(P<0.05)。结果表明,BMFB可能通过表达TLR4和NOD2识别PAMP,进而上调炎症细胞因子的表达。

DNA甲基化酶抑制剂对体细胞染色体的影响

在动物的体细胞克隆过程中,供体细胞的细胞核要由高度甲基化状态转变为胚胎细胞的非甲基化状态,从而实现全能性的重新获得。试验利用DNA甲基化酶(5-aza-dc)抑制剂处理供体细胞,尝试建立一种既不影响染色体结构和数目,又能降低供体细胞细胞核的甲基化状态的最适浓度和方法,从而提供一种提高体细胞克隆动物效率的方法。在试验中,用不同浓度的甲基化酶抑制剂(5-aza-dc)处理奶牛成纤维细胞72 h,通过常规染色体核型分析方法制备染色体分裂相,检测其染色体数目、结构等的改变,结果显示,低浓度的甲基化酶抑制剂(0.005和0.01μmol/L)处理,染色体没有发生明显的畸变(P>0.05),染色体能够保持正常的形态,高浓度(0.03与0.05μmol/L)处理导致染色体畸变率显著增加(P<0.05),而0.1μmol/L的5-aza-dc处理后染色体畸形率增加更为明显(P<0.01)。总之,此试验的结果说明在对供体细胞做甲基化处理时用0.005和0.01μmol/L的5-aza-dc处理不会影响细胞染色体结构和数目,但是高浓度处理则会导致染色体畸变率显著增加,不能用于体细胞克隆动物生产。