实时RT-PCR法检测感染小鼠不同组织标本中的委内瑞拉马脑炎病毒

目的为委内瑞拉马脑炎病毒所致疾病的早期诊断和流行病学研究提供技术支持。方法建立了委内瑞拉马脑炎病毒特异、敏感和快速的实时RT-PCR法,并对委内瑞拉马脑炎病毒感染昆明小鼠的不同组织标本中的病毒载量进行了定量检测。结果本研究建立的实时RT-PCR法敏感(10TCID50/ml)、特异(对其它甲病毒成员,如东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒检测为阴性)。该方法可从委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠后第1d的血液、脾脏、脑组织中检测到不同含量的病毒核酸,而在感染后第3d仅从脾脏和脑组织中检测到病毒核酸。结论实时RT-PCR法不仅是一种敏感、准确的检测方法,可用来了解病毒感染量与疾病严重程度的关系和评价病毒病疫苗的免疫效果,而且也为VEEV疾病的临床诊断和流行病学监测提供工具。

重组委内瑞拉马脑炎病毒疫苗的研制现状

委内瑞拉马脑炎病毒引起的委内瑞拉马脑炎是一种自然疫原性疾病。该病毒可诱导感染的宿主产生细胞、体液和粘膜免疫应答,可通过分子生物学技术改造为理想的疫苗载体,从而表达病毒和细菌的多种蛋白。这些病原体包括Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、流行性感冒病毒、人乳头瘤病毒16型、Norwalk样病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、麻疹病毒、炭疽杆菌和金黄色葡萄球菌等,本文综述委内瑞拉马脑炎病毒介导的病原体疫苗的研制现状。

委内瑞拉马脑炎病毒重组抗原的制备纯化及其胶体金免疫层析检测方法的建立

目的:表达委内瑞拉马脑炎病毒E2重组蛋白,并结合胶体金免疫层析技术建立一种简便检测委内瑞拉马脑炎病毒特异性抗体的方法。方法:利用已经构建的表达E2抗原的工程菌,用IPTG诱导,表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过一系列条件的变性、复性、透析,所制抗原用以包被硝酸纤维素膜,利用胶体金标记和免疫层析技术,建立委内瑞拉马脑炎病毒快速检测方法。对该方法的敏感性、特异性和稳定性作出评价。结果:重组工程菌可表达分子质量为40 kDa的目的蛋白,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE显示纯度达95%以上。建立的检测方法可在20 min内完成检测。对症状相似及近缘的其他病毒进行检测,均无非特异反应。试纸条在37℃下保存2周,检测结果不变。该方法与R&D公司商品化的ELISA试剂盒灵敏度检测无明显差异;对92份阴性血清进行检测,两种检测方法的符合率为96.7%。结论:重组委内瑞拉马脑炎病毒蛋白产生的包涵体变性复性后生具有良好的重复性和稳定性,可作为委内瑞拉马脑炎病毒多种检测方法的抗原原料。胶体金免疫层析法具有快速、灵敏、特异、稳定的特点,适用于现场检测。

委内瑞拉马脑炎病毒一步法荧光定量RT-PCR方法的建立

委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis,VEE)是由委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)复合物引起的一种人兽共患病。我国目前尚无该病,因此建立一种快速准确的检测方法对预防和控制该病至关重要。本研究通过分析委内瑞拉马脑炎病毒nsp1基因序列的保守性,设计了一对能检测VEEV复合物所有亚型毒株的特异性引物和Taqman探针。通过反应体系和反应条件优化,建立了检测委内瑞拉马脑炎病毒复合物的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。该方法检测VEEV经体外转录获得的RNA,检测的灵敏度达3.27×102拷贝/μL。以该方法检测与VEEV同属的东方马脑炎病毒(EEEV)和西方马脑炎病毒(WEEV)nsp1基因相同区段的RNA以及同属的基孔肯雅病毒(CHIKV),结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法将为可能在我国出现的委内瑞拉马脑炎的侦检提供有效技术手段。

委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。

建立快速检测委内瑞拉马脑炎的RT-LAMP技术

目的利用逆转录-环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立快速检测委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)的方法。方法针对VEEV nsp1基因序列,设计了5套特异性引物进行筛选,再对反应温度进行优化,最后进行特异性、灵敏性及重复性评价。结果RT-LAMP检测VEEV的最适温度在65℃;同时选取11种病毒进行RT-LAMP,证明了RT-LAMP具有高特异性;运用RT-qPCR与RT-LAMP对比灵敏性,结果表现为RT-LAMP检测的灵敏性超RT-qPCR检测的100倍。针对VEEV进行RT-LAMP的重复性实验,结果为具有较好的重复性。结论RT-LAMP检测VEEV法具有简单快速高效的特点,且装置简单,特异性强、灵敏性高、重复性好。

人体病毒学(致病病毒)

0244478 1992年兽疫流行的 IC 亚型委内瑞拉马脑炎病毒和紧密相关的 ID 亚型毒株的毒力和毒血症的特征/Wang E//AmJ Trop Med Hyg.-2001,65(1).

病毒传染病

0244808 抗流感还是抗死亡疫苗接种/Hall G H//Lancet.-2001,357(9274).-2141 医科图 0244809 ‘医院的满员’:1918年流感流行/Schoch Spana M//Public Health Rep.-2001,116(Suppl 2).-32～33

3种重要脑炎病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

目的:建立针对西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalomy-elitis virus,VEEV)和亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)的多重RT-PCR检测方法。方法:分别针对WNV的NS1基因、VEE的NSP2基因和HeV的G基因设计3对引物,建立了同时检测WNV,VEEV和HeV的多重RT-PCR方法。以不同滴度的病毒评估该检测方法的敏感性,同时以中国地区流行的与脑炎相关的黄病毒属和甲病毒属成员为模板验证该检测方法的特异性。结果与结论:所建立的3种病毒的多重RT-PCR方法可同时或分别特异扩增WNV,VEEV和HeV的454 bp,541 bp和723 bp基因片段,敏感度分别达到10 PFU/ml,100 PFU/ml和100 fg/ml;而对中国流行的与脑炎相关黄病毒和甲病毒如日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的扩增均为阴性。结果表明所建立的多重RT-PCR敏感性和特异性良好,可用于3种脑炎病毒的快速鉴定和甄别。

流行病学与防疫

0231863 抵抗衍生自委内瑞拉马脑炎病毒载体系统的肉毒杆菌毒素血清型 A 的候选疫苗/Lee J S∥Infect Immun.-2001,69(9).-5709～5715 医科图0231864

妊娠期感染致畸性病毒及母儿结局

Antoniou将孕妇可在妊娠期发生感染的病毒分第3类：一为已知的致畸病毒，共6种（人巨细胞病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒、水痘一带状疱疹病毒、人微小病毒B19及委内瑞拉马脑炎病毒）；二为病毒传播后可致胎儿损害，共10种（人类免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒等）；三为传播后胎儿不受损害，其6种（天花及狂犬病病毒等）。本文仅对第一类做一综述。

甲病毒受体MXRA8和LDLRAD3研究进展

甲病毒是感染人类和动物的重要病原体,该病毒属成员可分为两大类:一类可致关节炎,如基孔肯雅病毒;另一类可致脑炎,如委内瑞拉马脑炎病毒和东部马脑炎病毒。尽管对于甲病毒的研究已开展多年,但甲病毒的侵染机制和宿主抗病毒机制尚未清楚,亦未研制出有效的疫苗和抗病毒药物。近年来,基孔肯雅病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的受体基质重塑关联蛋白8(matrix remodeling associated 8,MXRA8)和低密度脂蛋白受体结构域蛋白3(low density lipoprotein receptor class A domain containing 3,LDLRAD3)相继被发现,鉴于这两种受体为最新发现,时效性较强,因此本文就这两种已知受体的研究进展进行总结概述,以期为甲病毒致病机制的进一步研究及相关疾病的预防控制提供新的思路。

世界一流科技期刊文章精选

委内瑞拉马脑炎病毒结合受体的分子机制中国科学院生物物理研究所章新政课题组和清华大学医学院向烨课题组合作,解析了委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)病毒样颗粒及其与人源受体分子LDLRAD3复合物的高分辨冷冻电镜结构,揭示了甲病毒家族核衣壳蛋白和糖蛋白相互作用的病毒颗粒组装机制,以及VEEV与受体特异性结合的分子机制。

引人注目的生物武器

所谓生物武器,系指由生物战剂及其施放装置组成的一种特殊武器。它是以伤害人畜、毁坏农作物为作战目的的非常规性武器。同核武器、化学武器一样,它亦被视为极具有危害的大规模杀伤武器。因最初多以病菌为战剂,以小动物和老鼠、昆虫、苍蝇、蚊子、跳蚤及其他杂物为施放载体,故而原称细菌武器。 随着生物技术的进步及其在军事上的广泛应用。