小鼠子宫内胚胎电转技术方法的改良

目的优化小鼠子宫内胚胎电转技术,用于检测胎鼠大脑新生神经元的迁移和分化特征。方法通过选择异氟烷气体麻醉方式,改进毛细玻璃针的制备方法,减少手术中胚胎的暴露时间,优化电转参数等,对小鼠子宫内胚胎电转技术进行一系列优化。采用优化的子宫内胚胎电转技术给6只怀孕16.5 d的孕鼠进行了手术,共电转胚胎42只。结果电转后孕鼠和胚胎的存活率达到100%,其中大脑表达外源基因的胎鼠占85%±3%。结论优化的小鼠子宫内胚胎电转技术可以获得令人满意的胎鼠存活率和基因电转效率。

N-WASP通过polyPro和VCA结构域调控大脑皮层神经元迁移

在大脑皮层发育过程中,神经元迁移是一个动态的复杂过程,与细胞骨架构建和重塑的调控息息相关。N-WASP蛋白是Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族(WASP-WAVE family)的一个重要成员,又名WAS-like蛋白(WASL),直接参与细胞骨架中肌动蛋白丝状分支的动态调控。本研究通过蛋白免疫印迹检测发现N-WASP表达于小鼠胚胎发育时期(E12.5~E18.5)的大脑皮层中,并且其表达水平随着发育逐渐降低。利用在体子宫内胚胎电转实验,结果发现过表达或者敲低N-WASP均会造成不同程度的大脑皮层神经元迁移障碍,说明N-WASP在大脑皮层神经元迁移中起到关键作用。N-WASP蛋白主要包含4个结构域:WH1、GBD、poly Pro和VCA。为进一步研究N-WASP各结构域在神经元迁移中的调控功能,设计了一系列的显性负性突变实验。通过过表达结构域删除的N-WASP蛋白,发现(35)poly Pro、(35)VCA和(35)WH1均能造成神经元迁移障碍。但是,过表达不能结合Cdc42的N-WASP蛋白(H208D突变体)却不能造成明显的神经元迁移障碍。另外,单独过表达N-WASP的结构域poly Pro或VCA能够造成神经元迁移障碍,而过表达WH1结构域却不能影响迁移。最后,通过过表达poly Pro和VCA结构域同时删除的N-WASP(WH1-GBD),发现WH1-GBD结构域对神经元迁移没有明显影响。上述结果表明N-WASP蛋白主要是通过poly Pro和VCA两个结构域调控大脑皮层神经元的迁移过程。