临床分离铜绿假单胞菌株的碳青霉烯类耐药机制研究

目的了解临床分离的碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌的耐药机制。方法对临床分离的40株碳青霉烯类耐药和10株对常用药物都敏感的铜绿假单胞菌及标准株ATCC27853,用抑制剂增效试验和双纸片协同试验筛选金属β-内酰胺酶;用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR法检测多药外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM及膜孔蛋白OprD的mRNA表达水平。结果在40株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中有33株金属β-内酰胺酶阳性,而10株敏感菌中无一株金属β-内酰胺酶阳性。与敏感菌相比,40株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中无MexAB-OprM过表达株,2株MexCD-OprJ过表达,8株MexEF-OprN过表达,6株MexXY-OprM过表达,10株OprD低表达,2株OprD缺失。一株菌中可同时存在几种异常。结论产金属β-内酰胺酶是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制;一株细菌中可同时存在多种耐药机制,且这些机制间并非简单的相加作用。

IMP-4型金属β内酰胺酶合并膜孔蛋白OmpK36缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药

目的 研究临床分离的肺炎克雷伯菌Z4和Z5对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制.方法 2008年从卫生部北京医院的急诊室和神经内科患者的痰标本分别分离到2株对碳青霉烯类抗生素不敏感的肺炎克雷伯菌Z4和Z5.测定菌株MIC,对菌株进行质粒接合试验、质粒消除试验、β内酰胺酶IEF分析、PCR扩增和DNA序列分析以及外膜蛋白分析.结果 亚胺培南、美罗培南和厄他培南对Z4和Z5的MIC分别为32、32和256μg/ml以及1、1和2μg/ml.接合试验可使受体菌大肠埃希菌对碳青霉烯的MIC值从≤0.062 5或0.125μg/ml上升到1或2μg/ml.PCR扩增和序列分析发现Z4产IMP-4型金属β内酰胺酶、TEM-1型和SHV-1型广谱β内酰胺酶 Z5产IMP-4、TEM-1和SHV-12型超广谱β内酰胺酶 2株细菌的转移接合子均只产IMP-4.质粒消除试验发现Z5的IMP-4质粒消除株（TEM-1和SHV-12阳性）对碳青霉烯类抗生素敏感,而Z4的IMP-4质粒消除株（SHV-1阳性）对碳青霉烯类抗生素敏感性降低（亚胺培南、美罗培南和厄他培南MIC分别为0.25、0.5和4μg/ml）.Z4和Z5的blaIMP-4基因均位于大小约55 000 bp质粒的I类整合子上.外膜蛋白的SDS-PAGE和ompK35/36基因序列分析发现Z4由于ompK36基因中存在点突变（CAG突变为TAG）造成基因表达提前终止而导致OmpK36膜孔蛋白缺失.结论 质粒介导的IMP-4型金属β内酰胺酶的产生或β内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白缺失均可引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性降低,IMP-4合并OmpK36膜孔蛋白缺失则可导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药.

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药机制检测

目的筛查大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌膜孔蛋白基因情况,分析其与耐药的关系。方法随机抽取2008—2010年耐3代头孢菌素(头孢他啶)的大肠埃希菌72株和肺炎克雷伯菌57株,56株头孢他啶敏感的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为对照组;三维试验确定细菌头孢菌素β-内酰胺酶(AmpC酶)的产生情况;超广谱β-内酰胺酶(ESBL)确证试验检测细菌产ESBL的情况;多重聚合酶链反应(PCR)扩增AmpC基因和膜孔蛋白ompF、ompk35、ompk36基因;纸片扩散法检测抗菌药物的敏感性。结果 72株大肠埃希菌中,14株产AmpC酶,23株产ESBL,3株膜孔蛋白基因缺失;57株肺炎克雷伯菌中,13株产AmpC酶,19株产ESBL,5株膜孔蛋白缺失,膜孔蛋白缺失株4代头孢均出现耐药。结论我院大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢类抗生素的耐药机制主要是产AmpC酶和ESBLs,同时膜孔蛋白基因的缺失会造成耐药程度增高。

碳青霉烯类耐药的不动杆菌分子流行病学及其泛耐药的分子机制

目的调查不动杆菌属对碳青霉烯类的耐药性,研究碳青霉烯类耐药的不动杆菌(CRAB)分子流行病学及耐药机制。方法收集2003—2004年我国10家教学医院187株鲍曼不动杆菌,采用琼脂稀释法确定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和随机引物多态性DNA(RAPD)分型对128株CRAB进行分子流行病学研究;对多种β内酰胺酶基因进行聚合酶链反应(PCR)及序列分析;对整合子可变基因进行PCR及序列分析。12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析CRAB菌株的外膜孔通道蛋白(OMP)。体外筛选亚胺培南的耐药突变子。结果多中心的数据显示,碳青霉烯类耐药率从2003年的4·5%升至2004年的18·2%,多重耐药菌株从2003年的33%升至2004年的48%。北京、广州、福州、杭州、济南的7家医院均发现CRAB耐药克隆的暴发流行。2004年北京协和医院发生泛耐药株的暴发,波及18个病房的74例患者,59·4%的患者(44例)为感染,主要引起肺部感染和菌血症,其中菌血症的病死率40·2%。耐药克隆株均产多种β内酰胺酶:OXA-23型碳青霉烯酶或IMP-8型金属酶、PER-1型酶、高产AmpC酶和TEM-1酶。整合子含有携带氨基糖苷类、利福平、氯霉素的修饰酶及金属酶(blaIMP-8)。不同克隆株OMP差异很大。利血平试验未发现外排机制的高表达。体外成功选择出亚胺培南的耐药突变子,OMP20000的缺失、OMP29000和OMP21000的表达降低是突变子耐药的主要原因。头孢哌酮/舒巴坦、黏菌素、米诺环素可以联合用于CRAB的治疗。结论CRAB克隆株的传播是造成中国多家医院碳青霉烯类耐药率增加的重要原因。不动杆菌通过产生碳青霉烯酶、不同基因盒的整合子、外膜孔蛋白多个通道的缺失,共同介导多重耐药性或泛耐药性。CRAB株引起的感染预后差,必须采取有效的感染控制措施和抗菌药物的干预政策以控制耐药株的传播。