孕烷X受体应答元件萤光素酶报告基因的构建及活性检测

目的建立孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)应答元件萤光素酶报告基因,并检测其活性。方法利用化学合成方法得到五聚体PXR应答元件(everted repeat elelment-6,ER-6元件)5和(direct repeat element-3,DR-3)5序列;将五聚体PXR应答元件序列(ER6或DR3)克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测PXR应答元件报告基因的活性。结果 PXR应答元件萤光素酶报告基因具有明确的活性。PXR激动剂茴香霉素能够剂量依赖地诱导ER6-Luc(R2=0.95;P=0.002 2)和DR3-Luc(R2=0.96;P=0.000 91)报告基因的活性,其EC50值分别为(0.11±0.04)μmol/L和(0.13±0.06)μmol/L;PXR拮抗剂酮康唑能够剂量依赖地降低茴香霉素诱导的ER6-Luc(R2=0.97;P=0.000 85)和DR3-Luc(R2=0.98;P=0.000 11)的活性,IC50值分别为(0.71±0.11)μmol/L和(1.73±0.15)μmol/L。结论成功构建了PXR应答元件报告基因,建立了PXR转录活性的检测方法。

银杏内酯B通过激活孕烷X受体诱导CYP3A4的表达

目的研究银杏内酯B(ginkgolide B)对CYP3A4的诱导作用,进一步验证是否通过激活孕烷X受体实现对CYP3A4 mRNA和蛋白水平的诱导表达。方法用不同浓度银杏内酯B处理LS174T细胞,通过Q-PCR法检测CYP3A4 mRNA表达变化,进一步利用本实验室构建的PXRCYP3A4稳定转染HepG2工程细胞株,结合荧光素酶报告基因技术,显示检测银杏内酯B对PXR的转录激活活性的影响。蛋白质免疫印迹法检测CYP3A4蛋白水平表达的变化;利用siRNA技术敲低PXR的mRNA表达,检测在PXR低表达的条件下银杏内酯B对CYP3A4 mRNA和蛋白水平表达影响。结果银杏内酯B可以浓度依赖性的使CYP3A4基因及蛋白表达水平上调,报告基因结果显示,银杏内酯B能够浓度依赖性的增强PXR的转录激活活性,在PXR低表达的条件下,银杏内酯B对CYP3A4诱导作用明显低于正常表达组PXR。结论以上表明银杏内酯B通过激活PXR受体,促进其转录激活活性进而诱导CYP3A4表达上调,同时对PXR自身的表达无明显影响。

染料木黄酮、拟雌内酯及槲皮素对孕烷X受体介导的CYP3A4转录的调节作用

目的 研究植物雌激素中的染料木黄酮(GST)、拟雌内酯 (COM)及槲皮素 (QU)能否通过活化人孕烷X受体 (PXR)诱导CYP3A4的转录表达。方法用PXR依赖的瞬时转染报告基因试验检测 3种植物雌激素的诱导作用。结果 GST ,COM和QU均能通过活化PXR诱导HepG2 细胞CYP3A4基因的转录表达 ,最大诱导倍数 (相对于用浓度为 0 .1%的DMSO处理的细胞 )在本实验中分别为 11.97(P <0 .0 1) ,2 .98(P <0 .0 1)和 3.2 8(P <0 .0 1)。结论 GST ,COM和QU均能诱导CYP3A4的转录表达 ,其作用机制通过活化PXR。GST ,COM和QU的摄入可能影响其他CYP3A4底物尤其是药物在体内的代谢。

银杏叶提取物及其萜类单体对人孕烷X受体介导CYP3A4转录的调节作用

目的研究银杏叶提取物(GBE)及其萜类单体白果内酯(BB)、银杏内酯A(GA)和银杏内酯B(GB)是否能通过孕烷X受体(PXR)的活化而诱导CYP3A4转录。方法采用脂质体瞬时转染的方法,在人肝肿瘤细胞株HepG2细胞中转入PXR表达质粒、CYP3A4报告基因质粒和内参质粒,与不同浓度的银杏叶提取物及其萜类单体(BB、GA和GB)共同孵育24h后,检测细胞中荧光素酶。结果GBE(100ng/mL、500ng/mL、5μg/mL和25μg/mL)分别通过活化PXR诱导CYP3A41.32、1.57、1.71和1.92倍,BB(10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL)分别通过活化PXR诱导CYP3A41.52、1.79和1.89倍,GA和GB则不能通过活化PXR诱导CYP3A4。结论GBE和BB能通过PXR的活化而诱导CYP3A4转录,GA和GB不能活化PXR,对CYP3A4转录无诱导作用,提示在GBE或BB与CYP3A底物合用时要注意药物之间的相互作用。

豆腐果苷对人孕烷X受体介导的CYP3A4和MDR1的转录调节作用

目的:建立和验证人孕烷X受体(human pregnant X receptor,hPXR)介导的CYP3A4、MDR1药物诱导剂的体外筛选体系,考察豆腐果苷对hPXR介导的CYP3A4、MDR1的转录调节作用。方法:利用构建的双荧光素酶报告基因系统,将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞,以10μmol/L利福平为阳性对照,用不同浓度(0.004、0.04、0.4μmol/L)豆腐果苷处理48h后裂解细胞进行双荧光素酶活性检测。结果:不同浓度的豆腐果苷均不能通过激活hPXR来介导CYP3A4和MDR1表达上调,各浓度处理组的双荧光素酶比活性值与DMSO溶媒组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建了hPXR介导的CYP3A4和MDR1药物诱导剂的体外筛选体系,并发现豆腐果苷不能通过激活hPXR介导CYP3A4和MDR1的表达上调。

孕烷X受体对细胞色素P450 CYP3A基因表达的调控在中药配伍禁忌及中药毒性早期预测中的应用

中药配伍禁忌是药物与机体相互作用本质的具体体现,是中药配伍理论的重要组成内容。毒性早期预测是药物安全性评价的重要组成部分。快速、早期获得药物可能的毒性反应数据,建立一种简单、可靠地中药配伍禁忌和中药毒性早期预测方法,是当今毒理学领域研究的重点之一。孕烷X受体(PXR)是一种配体依赖性转录因子,大量临床药物作为其配体或激活剂通过激活PXR而诱导细胞色素P450 CYP3A(CYP3A)基因表达。联合用药过程中,PXR的激活可能会增加药物发生相互作用和不良反应的风险,导致药效降低甚至产生毒性。本文从PXR-CYP3A途径为药物相互作用研究提供分子学机制,以及为中药配伍禁忌的研究和药物毒性早期预测提供了新思路。

沉默孕烷X受体增强结肠癌LS174T细胞对奥沙利铂敏感性的影响

目的观察沉默孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)表达对结肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响,初步探讨其可能机制。方法构建PXR基因的siRNA质粒表达载体,转染结肠癌LS17T细胞,并建立稳定表达细胞,用RT-PCR和Western blot方法检测特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)和多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance-asso-ciate protein 3,MRP3)表达,MTT方法检测奥沙利铂化疗敏感性。结果成功建立PXR敲低细胞克隆PXRi 1#、PXRi 2#;在PXRi 1#和PXRi 2#细胞克隆中,MRP3 mRNA及蛋白表达明显下降,SP1表达也下降;与PXRi control相比,细胞克隆PXRi 1#、PXRi 2#奥沙利铂的IC50值均显著降低[(4.83±0.22)、(4.75±0.19)vs(9.44±0.37),P<0.05]。结论 PXR表达沉默可增强结肠癌LS174T细胞对奥沙利铂化疗敏感性,这可能与PXR沉默后,SP1、MRP3表达下调相关。

山姜素激活孕烷X受体和上调CYP3A4 mRNA转录的研究

目的探讨山姜素能否通过活化孕烷X受体(PXR)诱导CYP3A4的转录表达及对CYP3A4 mRNA的实际诱导作用。方法在人结肠癌LS174T细胞中,用瞬时共转染报告基因实验研究山姜素(1～50μmol.L-1)对PXR介导的CYP3A4基因的转录激活;用荧光定量RT-PCR方法检测其对CYP3A4 mRNA的实际诱导。结果 10μmol.L-1浓度山姜素能够通过活化PXR诱导CYP3A4的转录(1.63倍);10和20μmol.L-1山姜素能够明显上调CYP3A4 mRNA(2.28倍和1.65倍)的表达。结论 PXR途径也许是山姜素诱导CYP3A4基因表达的调控因素之一。

孕烷X受体生物特性及其在药物代谢中的作用研究进展

核受体孕烷X受体是一类生物体内广泛分布的激素和环境感受器,不仅可参与能量、胆固醇、胆汁酸等物质的代谢以及调节炎症反应,还可以调控Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶和相关药物转运蛋白的表达而调节药物代谢,其作用对维持机体诸如细胞增殖分化、生长发育、新陈代谢、稳态维持等多种生理功能有重要意义。本文就孕烷X受体结构功能、生物学效应以及其对药物代谢酶和药物转运调节的作用等作一综述。

孕烷X受体的研究进展及其在药物代谢中的作用

孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)是机体对有毒物质适应性防卫机制的一个重要组成部分,PXR被大量的外源性和内源性化学物质激活,这些物质包括类固醇、抗生素、抗真菌的物质和胆汁酸等。PXR配体结合区域三维结构显示它具有一个特殊球形配体结合腔,这种结构允许PXR与广泛的疏水性化学物质结合。PXR与9-顺式维甲酸受体(9-cisretinoic aid receptor,RXR)以异型二聚体的形式与细胞色素氧化酶P450 3A家族和其他参与药物代谢的Ⅱ相药物代谢酶以及药物转运蛋白的DNA响应元件结合,通过外源物刺激诱导多个基因的表达。分析PXR的结构与功能对药物设计和筛选具有重要的应用价值。

孕烷X受体的研究进展

孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)属于核受体超家族(NRs)中的NR1I亚家族,主要在肝脏、小肠、胃、肾脏等组织中高表达。自该受体发现以来已相继克隆出小鼠、大鼠、猴及人等哺乳动物的PXR。PXR作为内源及外源物激活受体在机体的防御机制中发挥重要的生物调节作用和"解毒"功能。此外,大量研究还表明PXR通过调节下游靶基因的表达而广泛参与机体的物质及能量代谢,并在某些疾病的发生发展中发挥重要作用。本文就PXR的新近研究进展做一综述。

孕烷X受体对细胞色素P450 3A调控机制的研究进展

细胞色素P450 3A(CYP3A)是参与临床药物代谢的主要CYP同工酶之一。孕烷X受体(PXR)属于核受体超家族(NR)的NR1Ⅰ亚家族。该受体作为药物代谢的关键转录调控因子,参与CYP3A的诱导表达。药物可通过多种途径激活PXR受体调控cyp3a基因的表达,其中包括PXR与其他核受体、转录因子及细胞信号转导通路间的相互作用等多种途径。目前,基于PXR的筛选方法已广泛应用于早期新药研发。

孕烷X受体对CYP3A基因表达的调控作用及其在药物代谢中的意义

细胞色素P450 3A(cytochrom e P4503As,CYP3As)在药物代谢过程中起重要作用,外源性化学物对肝脏CYP3A基因表达有明显的诱导作用。孕烷X受体(pregnane X recep-tor,PXR)是新发现的孤儿核受体(系统名:NR1 I2)。PXR与另一重要核受体RXR结合形成二聚体结合于CYP3A基因顺式反应元件,参与对CYP3A基因表达的调控作用。大量临床处方药物通过激活PXR而诱导CYP3A基因表达,构成了临床药物间相互作用的分子基础。

旱莲草单体对人孕烷X受体调控CYP3A4转录表达的调节作用

目的研究旱莲草5种中药单体木犀草素、芹菜素、槲皮素、刺囊酸和蟛蜞菊内酯是否可以通过PXR的激活而诱导CYP3A4转录表达。方法采用MTT法检测5种中药单体对人结肠癌细胞系LS174T细胞的毒性,采用脂质体瞬时转染的方法,在LS174T细胞中同时转入人PXR表达质粒、CYP3A4报告质粒以及内参质粒,建立双荧光报告基因体系,与不同浓度及不同给药时间的中药单体共同孵育,检测细胞中荧光素酶。结果 5种中药单体对LS174T的IC50值分别为木犀草素(71.08±5.35)μmol/L、芹菜素(185.54±9.57)μmol/L、槲皮素(112.68±8.34)μmol/L、蟛蜞菊内酯(36.01±9.37)μmol/L、刺囊酸(26.04±5.62)μmol/L。刺囊酸(5、10和20μmol/L)分别诱导PXR调控的CYP3A4表达(1.52±0.31)倍、(1.95±0.31)倍和(2.57±0.23)倍,蟛蜞菊内酯(5、10和20μmol/L)分别诱导PXR调控的CYP3A4表达(1.57±0.30)倍、(1.91±0.25)倍和(2.14±0.51)倍,木犀草素、槲皮素、芹菜素在试验的浓度范围内不能明显诱导LS174T细胞中PXR调控的CYP3A4表达。在不同给药时间试验中,10μmol/L和20μmol/L的刺囊酸在12～48 h能诱导PXR调控的CYP3A4表达,诱导能力随时间的延长而呈增强的趋势,各浓度的最大诱导倍数均在48 h出现;10μmol/L和20μmol/L的蟛蜞菊内酯只能在12～24 h诱导PXR调控的CYP3A4表达,在48 h时2个浓度组均出现诱导表达倍数的下调。结论刺囊酸和蟛蜞菊内酯在LS174T细胞系中可以通过激活PXR诱导CYP3A4转录表达,而木犀草素、芹菜素、槲皮素无此作用。

中国汉族人孕烷X受体基因NR1I2的单核苷酸多态性

目的了解中国健康汉族人孕烷X受体基因NR1I2的单核苷酸多态性分布以明确种族差异。方法用PCR扩增后直接测序的方法,检测NR1I2基因2和4外显子及1,2,4和5内含子的单核苷酸突变。结果中国健康汉族人NR1I2基因2和4外显子均未发现已报道的单核苷酸突变,外显子1和内含子1,2,4和5检测到单核苷酸突变9种,分别为-24446C>A,-24381A>C,-24113G>A,252A>G,275A>G,4760G>A,7635G>A,7637C>T和7675C>T,等位基因频率分别为2.4%,20.8%,20.8%,33.3%,31.0%,68.5%,31.7%,1.6%和10.6%,其中7637C>T未见在任何文献和单核苷酸多态性数据库中报道,为新发现突变。结论中国健康汉族人NR1I2内含子1,2,4和5位置检测到9种单核苷酸突变,且突变频率较高,与白人和美国黑人比较,单核苷酸突变的发生位点和发生频率存在显著性差异。

中国健康汉族人孕烷X受体的基因多态性

目的研究中国健康汉族人孕烷X受体的基因突变情况,并与高加索人和非洲裔美国人突变频率进行比较。方法PCR扩增后直接测序。结果在中国汉族人未发现已报道的PXR*2,3,4突变,与非洲裔美国人的PXR*2,3的基因型频率比较有显著性差异;A11156C与T11193C突变基因频率分别为45.5%,41.5%,与高加索人和非洲裔美国人的基因频率比较有显著性差异。结论中国健康汉族人与高加索人、非洲裔美国人比较,突变基因频率均有明显种族差异。

慢病毒介异的孕烷X受体sh-RNA稳定干扰HepG2细胞株的构建

目的:构建慢病毒介导的人孕烷X受体(hPXR)sh-RNA干扰载体及筛选肝癌细胞稳定干扰株。方法:针对hPXR的特异性序列,设计干扰序列,构建重组克隆。转染HEK293T细胞,筛选有效干扰片段。HEK293T包装干扰病毒并转染肝癌HepG2细胞株,200 mmol/L嘌呤霉素筛选2-3周,Western blot检测PXR表达。hPXR激动剂利福平处理PXR sh-RNA稳定干扰肝癌HepG2细胞株和Scramble对照细胞,抽提RNA并鉴定hPXR靶基因细胞色素P450 3A4(CYP3A4)的表达。结果:筛选出了PXR有效干扰片段,并获得了PXR信号通路有效敲低的HepG2慢病毒稳定干扰株。结论:成功构建了慢病毒介导的PXR sh-RNA稳定干扰HepG2细胞株。

孕烷X受体研究进展

孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)是核受体超家族成员之一,以同名内源性配体孕烷命名,主要表达在肝脏、小肠、胃、肾脏等组织,在机体异源性/内源性物质的代谢及排泄过程中起重要的调节作用。近年的研究表明,PXR还可以通过调节其下游靶基因的表达,直接参与机体脂质、胆固醇和糖代谢,维持机体内环境的稳态。本文将就PXR的研究进展做一综述。

孕烷X受体可上调HepG2细胞内PDCD4的表达

目的探究孕烷X受体(PXR)对HepG2细胞程序性细胞死亡因子(PDCDs)的调控作用及其分子机制。方法 HepG2细胞给予不同的PXR激动剂刺激24 h,分为利福平(10μmol/L)组、SR12813(1μmol/L)组和DMSO对照组;采用持续激活型PXR的腺病毒感染HepG2细胞(VP-PXR组和Mock对照组)36 h。应用qRT-PCR技术检测PDCD2、PDCD4、PDCD5、PDCD6基因以及miRNA21的表达变化,采用Western blot技术检测PDCD4的蛋白表达水平。运用生物信息学方法预测PDCD4启动子区存在的潜在PXR结合反应元件(PXREs)。结果 qRT-PCR结果显示利福平与对照组相比,PDCD2的表达显著下调(t=-2.875,P<0.05),PDCD4表达则显著上调(t=4.209,P<0.01),而PDCD5和PDCD6无明显差异。SR12813与对照组相比,PDCD4表达明显升高(t=4.574,P<0.01),PDCD2、PDCD5和PDCD6均无明显变化。同时,利福平、SR12813组与对照组相比,PXR经典靶基因MDR1的表达显著升高(P<0.05);VP-PXR与Mock对照组相比,PDCD2和PDCD6的基因表达无明显差异,PDCD4基因的表达则显著上调(t=3.343,P<0.05),MDR1的表达也显著升高(t=3.343,P<0.01);给予利福平刺激后,PDCD4的蛋白表达比对照组显著升高(t=2.779,P<0.05);PDCD4的蛋白在VP-PXR组也显著高于Mock组(t=3.066,P<0.05);机制研究发现利福平或VP-PXR腺病毒刺激细胞后与各自对照组相比,PDCD4上游负调控因子miRNA21表达均无明显差异。利用生物信息学软件分析后发现,PDCD4启动子区存在PXREs。结论 PXR活化上调HepG2细胞内PDCD4的表达,但不依赖于miRNA21,PDCD4在HepG2细胞可能是PXR的靶基因。

中草药对孕烷X受体和组成型雄烷受体等核受体通路影响的研究进展

孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)是核受体亚家族的成员之一,参与大量的外源性和内源性化学物质的生物转化,能被多种中草药激活,调节下游靶基因的表达,在药物代谢酶和转运体的调节中起重要作用。组成型雄烷受体(constitutive androstane receptor,CAR)和PXR一样能与外源性配体结合调节CYP2B6、CYP3A4、CYP2C19、UGT1A1的表达,共同参与CYP药物代谢酶的调节,成为药物作用的靶标。