金钱鱼孕激素受体基因的克隆、鉴定与表达研究

核受体(Pgr),隶属于核受体超家族,由核受体亚家族3C组成员3基因编码。孕酮通过结合Pgr介导其在脊椎动物繁殖过程中的生理学功能,因此,研究金钱鱼核受体基因(pgr基因)在不同组织及不同发育时期性腺中的表达模式,有助于为金钱鱼的繁殖提供理论依据。笔者克隆金钱鱼的pgr基因,用Megalign软件比较Pgr氨基酸同源性,用MEGA 7.0.4软件构建系统进化树,利用反转录PCR和实时荧光定量PCR分别探究pgr mRNA在金钱鱼各组织和性腺发育过程中的表达。金钱鱼pgr基因的开放阅读框(ORF)的长度为2016 bp,共编码671个氨基酸。氨基酸序列相似性分析发现,它与同属一个分支的鲈形目大黄鱼同源性最高。组织分布结果显示,pgr基因在雌、雄金钱鱼各组织中均有表达,且性腺、垂体中的表达最高。在垂体中,外源雌激素17β-雌二醇(E2)能显著升高pgr基因的表达。此外,随着性腺的发育,pgr基因在性成熟金钱鱼精巢、卵巢中的表达量最高。因此,Pgr对金钱鱼的生殖细胞发育成熟可能十分重要。

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2表达的影响

研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2(SBD2)基因表达的影响,探讨P4调节SBD2表达的潜在机制。建立绵羊输卵管上皮细胞体外培养体系,用不同浓度(10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol/L)P4分别处理绵羊输卵管上皮细胞0、2、6、12、24、48h,筛选P4诱导绵羊输卵管上皮细胞SBD2mRNA表达的最佳条件。然后使用10-6mol/L孕激素核受体拮抗剂RU486,50μmol/L蛋白激酶C(PKC)信号通路阻断剂H7预处理细胞1h,再使用P4诱导SBD2mRNA表达的最佳条件处理细胞,同时设只添加阻断剂(RU486和H7)处理组、只添加孕酮(P4)处理组和空白对照组,通过RT-qPCR技术检测SBD2mRNA的表达变化。10-9mol/LP4诱导绵羊输卵管上皮细胞6h和24h时SBD2mRNA表达显著高于对照组(P<0.01),且与P4组相比,添加RU486和H7后显著抑制了P4诱导的SBD2mRNA的表达水平(P<0.01)。P4以浓度和时间依赖性方式显著增加SBD2mRNA表达,并且诱导可能通过孕酮核受体(PR)介导的基因组途径以及PKC信号通路来提高绵羊输卵管上皮的先天免疫防御能力。

DHP及其核受体诱导斑马鱼IFI44表达及细胞定位研究

为了明确17α,20β双羟孕酮(DHP)及其核受体调控干扰素诱导蛋白44(IFI44)mRNA在雄性斑马鱼组织中的表达机制及细胞定位,试验采用荧光定量PCR法测定IFI44mRNA组织分布及相对表达量,采用活体和离体E2与DHP暴露方法明确雌二醇(E2)单独暴露及与DHP联合暴露对斑马鱼IFI44mRNA相对表达量,采用原位杂交方法明确IFI44在精巢面积中的定位。结果表明:IFI44mRNA呈组织差异性分布,脑、心脏、肌肉和肝脏中表达量较少,脾脏和精巢中表达量丰富,差异显著(P<0.05);活体10nmol/LE2暴露野生型雄性斑马鱼21d,取精巢组织离体100nmol/LDHP暴露24h,E2+DHP处理组精巢组织IFI44mRNA表达量显著高于单独E2处理组(P<0.05);活体10nmol/LE2暴露野生型和孕酮核受体敲除型雄性斑马鱼各21d,取精巢组织离体100nmol/LDHP暴露24h,孕酮核受体敲除型雄性斑马鱼E2+DHP处理组IFI44mRNA的表达量显著低于野生型雄性斑马鱼E2+DHP处理组(P<0.05),但显著高于两种类型雄性鱼单独E2处理组(P<0.05);IFI44原位杂交试验显示基因主要表达于精巢组织支持细胞中。说明DHP及其核受体诱导表达的IFI44极大可能参与了斑马鱼精子发育过程。

DHP及其核受体诱导斑马鱼促性腺激素释放激素mRNA表达

为了明确17α,20β双羟孕酮(DHP)及其核受体调控促性腺激素释放激素mRNA在雄性斑马鱼脑组织中的表达机制,采用实时荧光定量PCR方法、类固醇激素活体和离体暴露方法进行试验。结果表明,野生型雄性斑马鱼活体暴露于100 nmol/L DHP水溶液,伴随暴露时间的延长,gnrh2和gnrh3 mRNA表达量呈逐渐升高趋势,24 h出现表达最高峰;野生型雄性斑马鱼活体分别暴露于10和100 nmol/L DHP水溶液24 h。与对照组相比,100 nmol/L DHP试验组gnrh2和gnrh3 mRNA表达量升高,差异显著(P<0.05),而10 nmol/L DHP试验组无显著变化(P>0.05);野生型雄性斑马鱼活体暴露于100 nmol/L DHP与100 nmol/L RU486混合水溶液24 h,试验组gnrh2和gnrh3 mRNA表达量与对照组相比无显著变化(P>0.05);野生型和孕酮核受体敲除型(pgr-/-)雄性斑马鱼活体分别暴露于100 nmol/L DHP水溶液24 h,与野生型试验组相比pgr-/-型试验组gnrh2和gnrh3 mRNA表达量显著降低(P<0.05);野生型和pgr-/-型雄性斑马鱼脑组织离体暴露于含100 nmol/L DHP的L-15培养液24 h,与野生型试验组相比pgr-/-型试验组gnrh2和gnrh3 mRNA表达量显著降低(P<0.05)。由此可见,DHP与核受体结合可直接调控雄性斑马鱼脑组织中促性腺激素释放激素gnrh2和gnrh3 mRNA表达。