自制细胞冻存液对树突状细胞存活率及活性的影响

目的:用自制的改良细胞冻存液冻存树突状细胞(dendritic cells,DCs),观察冻存复苏后DCs的细胞存活率及体外诱导CIK(cytokine induced killer cell)对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:从外周血分离、培养获得DCs,分别用3种冻存液冻存:(1)含10%二甲基亚砜(DMSO)、20%牛血清的RPMI1640培养液;(2)日本ZENOAQ公司的Cellbanker细胞冻存液;(3)自制细胞冻存液(含DMSO、羟乙基淀粉及细胞稳定剂)。每组DCs分6管,于-80℃和-196℃各冻存3管,分别于冻存后第30、60和180d复苏,用锥虫蓝染色法测定细胞存活率,用MTT法检测冻存复苏后DCs活化的CIK对K562细胞的杀伤活性。结果:每组3种冻存液冻存的DCs随着冻存时间的延长,冻存复苏DCs的存活率和活性均有轻度下降,但经统计学分析3种冻存液的冻存效果无明显差别。结论:自制的改良细胞冻存液能够替代传统冻存液和进口冻存液用于DCs的冻存,有良好的推广前景。

不同冻存液对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察不同冻存液对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)冻存复苏后生物学特性的影响,优化冻存方法。方法脐带取自2011年1月至2011年12月在中山大学附属第三医院产科剖宫产的足月健康产妇。从脐带分离得到的hUC-MSC培养传代,取第3代细胞。根据冻存液不同分为3组,A组冻存液为二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)∶胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)∶低糖杜氏培养基(low glucose Dulbecco's modified Eagle's medium,LG-DMEM)为1∶2∶7,B组为DMSO∶FBS∶LG-DMEM为1∶5∶4,C组为DMSO∶FBS为1∶9,不含LG-DMEM。经冻存12个月,复苏细胞,以第3代未冻存细胞悬液作为对照组,采用台盼蓝染色法比较hUC-MSC的细胞存活率,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法比较细胞的生长情况绘制生长曲线,倒置显微镜下观察细胞的生长状况,采用流式细胞仪检测各组细胞的表面标记。结果A、B、C三组的细胞存活率分别为(20±4)%、(71±8)%和(85±7)%。与C组比较,A组和B组的细胞存活率降低,差异有统计学意义(均为P<0.05)。细胞生长曲线显示,与对照组相比,C组hUC-MSC在各时间点细胞生长迅速,但差异无统计学意义(P>0.05);B组hUC-MSC在24 h、48 h、72 h细胞生长差异无统计学意义(P>0.05),在96 h时间点生长速率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而A组hUC-MSC在各个时间点细胞生长减慢,差异有统计学意义(均为P<0.05)。形态学观察显示,A组细胞胞体宽大多角,并且较多分支,B组和C组细胞饱满,折光性好,呈长梭形、纺锤形或多角形。A组细胞复苏后细胞数目过少无法进行表面标记,B组和C组hUC-MSC表面标记物CD31、CD34、CD45、人类白细胞抗原(HLA)-DR表达阴性,CD105、CD90、CD44表达阳性。结论含高浓度血清的冻存液适合hUC-MSC的长期保存,含90%FBS的冻存液为hUC-MSC的最佳冻存保护液。

不同冻存液对人羊膜间充质干细胞-80℃冻存与复苏效果的影响

目的:观察不同冻存液对人羊膜间充质干细胞冻存复苏后的存活率及再培养情况的影响,并探索简单有效的冻存与复苏方法。方法:将含有血清培养基短期体外培养的人羊膜间充质干细胞分为4组,分别加入不同冻存液(体积分数):A组10%二甲基亚砜+40%胎牛血清+50%DMEM/F12,B组10%二甲基亚砜+90%胎牛血清,C组5%二甲基亚砜+4.5%羟乙基淀粉+20%胎牛血清+70.5%DMEM/F12,D组10%胎牛血清+90%DMEM/F12。以相同方法冻存并复苏细胞,比较4组细胞回收率及再培养情况。结果:A、C2组细胞复苏后回收率高于另外2组(P均<0.05),且于复苏后再培养24h内出现较多贴壁细胞。结论:以5%二甲基亚砜+4.5%羟乙基淀粉+20%胎牛血清+70.5%DMEM/F12作冻存液冻存羊膜间充质干细胞效果好。

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组:85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组:75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组:85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组:75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组:70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组:60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明:BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。

不同人羊膜间充质干细胞冻存液冻存细胞效果比较

目的:筛选冻存人羊膜间充质干细胞效果较好的冻存液。方法:①不同配方的细胞冻存液对细胞冻存效果的影响。人羊膜间充质干细胞培养至第三代后分为10组,分别加入以下10种不同组成的冻存液。A组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%DMSO;B组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%DMSO;C组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;D组:90%胎牛血清+10%DMSO;E组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%甘油;F组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%甘油;G组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%甘油;H:90%胎牛血清+10%甘油;I组:90%DMEM/F12+10%DMSO;J组:90%DMEM/F12+10%甘油。调整细胞密度为5×106mL-1,放入程序降温盒中,入-80℃低温冰箱保存。1个月后复苏,MTT法筛选出吸光光度值较高的一种冻存液。②相同血清含量细胞冻存液对细胞冻存效果的影响。含体积分数为50%胎牛血清的细胞冻存液分3组保存细胞。K组:45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO;L组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;M组:35%DMEM/F12+50%胎牛血清+15%DMSO;复苏冻存的细胞后,将细胞按冻存前的数量调整至5×105mL-1,台盼蓝染色后,计算细胞的成活率。在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况。结果及结论:配方为45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO的冻存液冻存复苏人羊膜间充质干细胞后细胞的成活率最高(P<0.05);冻存复苏后细胞的生长状况较好。

不同配比冻存液对兔脂肪干细胞液氮冻存效果的研究

目的:探究不同浓度配比冻存液对脂肪干细胞(Adipose-derived Stem Cells,ADSCs)冻存复苏后存活率及增殖活性的影响。方法:无菌条件下取新西兰大白兔的脂肪组织,体外分离、培养ADSCs并传代至第3代,行免疫细胞化学染色对其表面标志物进行鉴定,同时对其行成软骨及成表皮细胞诱导以证实其多项分化能力。将第3代ADSCs置于液氮(-196℃)中冻存,根据冻存液中培养基(DMEM)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)及二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)的配比不同分为8组:1含不同浓度FBS配比分组:A组(70%DMEM+20%FBS+10%DMSO)、B组(60%DMEM+30%FBS+10%DMSO)、C组(50%DMEM+40%FBS+10%DMSO)、D组(含有40%DMEM+50%FBS+10%DMSO);2含不同浓度DMSO配比分组:E组(55%DMEM+40%FBS+5%DMSO)、F组(50%DMEM+40%FBS+10%DMSO)、G组(45%DMEM+40%FBS+15%DMSO)、H组(40%DMEM+40%FBS+20%DMSO)。细胞冻存三个月后,对其进行复苏并观察细胞形态学变化;通过细胞计数计算细胞存活率;采用MTT法绘制复苏后细胞生长曲线,以测定其生长增殖情况。结果:细胞复苏后,通过细胞计数计算结果显示C、D组存活率明显高于A、B组(P<0.05),E、F、G、H四组之间有统计学意义(P<0.01);MTT法结果显示C、D、F组的增殖曲线与未冻存组无明显差异(P>0.05)。结论:从兔脂肪组织中成功分离出了ADSCs,并且能在体外培养过程中稳定生长,快速增殖;ADSCs冻存液比例选择以DMEM:FBS:DMSO=5:4∶1的冻存效果最好。

细胞的简易冻存技术与冻存液的选择

在组织培养和细胞杂交工作中,培养细胞的保种十分重要。目前保存细胞的唯一途径是液氮冻存。我们试用简易冷冻技术和不同的冻存液,对数种细胞株/系进行了冻存、复苏试验,现报告如下。

谷胱甘肽与富氢冻存液在鸡血细胞冻存中的保护作用

目的通过观察细胞冷冻复苏后的存活率及凋亡情况,探讨细胞冻存液中添加谷胱甘肽(GSH)和氢气(H_2)对细胞的保护作用。方法在冻存液中添加GSH和/或通入H_2后冻存鸡血细胞,1个月后复苏,采用台盼蓝拒染和MTT法分别检测细胞存活率与细胞活性,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果 GSH、H_2或H_2+GSH处理使细胞活力明显提高,而早期凋亡率明显降低。结论谷胱甘肽与富氢冻存液对鸡血细胞冻存具有保护作用。

一种新贴壁细胞冻存液的研发与评价

目的评价一种新的贴壁细胞冻存液。方法使用含7.5%二甲基亚砜(DMSO)(V/V%)、17.5%丙二醇(V/V%)、2.5%聚乙二醇(V/V%)、10%胎牛血清(FBS)(V/V%)的达氏修正依氏培养液(DMEM)作为新型冻存液,对MDCK、LLC-MK2、HEp-2等3种贴壁细胞进行冻存实验。实验分常规冻存组、贴壁细胞冻存对照组和贴壁细胞冻存组,通过观察细胞形态并以HEp-2细胞为典型绘制细胞生长曲线;利用细胞病变法及免疫荧光法检测复苏的贴壁细胞对甲型流感病毒、副流感3型病毒、呼吸道合胞病毒的敏感性变化。结果3种贴壁细胞冻存组复温后细胞保持完整的单层贴壁状态,与常规冻存组细胞复苏培养3 d后的新鲜贴壁细胞形态一致;3种贴壁冻存对照组细胞复苏后其细胞大量死亡,数量急剧减少,细胞间隙增大,细胞呈破碎样。生长曲线结果显示HEp-2贴壁细胞冻存组一直保持5×10^(5)/mL水平。对上述病毒的敏感性检测中,贴壁细胞冻存组呈现出典型的细胞病变;感染甲型流感病毒的MDCK贴壁冻存细胞荧光呈胞浆颗粒型或细胞核均质型;感染呼吸道合胞病毒的HEp-2贴壁冻存细胞荧光呈胞浆颗粒型,合胞体中亦可见小块包涵物染荧光;感染副流感3型病毒的LLC-MK3贴壁冻存细胞荧光呈胞浆颗粒型强绿色荧光。结论新研发的贴壁细胞冻存液可用于多种贴壁细胞的原位冻存,能保持细胞活力和对病毒的敏感性,为大批量即用型细胞产品的开发应用奠定基础。

细胞短期冻存液的优化研究

目的:探索不同配方的冻存液对细胞短期冻存复苏后存活率及增殖活性的影响,进而对细胞短期冻存液配比进行优化。方法:将多种贴壁细胞及悬浮细胞分别用4种不同配比冻存液冻存[(A)10%二甲基亚砜(DMSO)+10%胎牛血清(FBS)+80%DMEM/1640培养基;(B)10%DMSO+20%FBS+70%DMEM/1640培养基;(C)10%DMSO+50%FBS+40%DMEM/1640培养基;(D)10%DMSO+90%FBS],程序性降温(平均降温速率-1℃/min)至-80℃,冻存4 d后以相同方法复苏细胞并观察细胞生长形态学变化,分别拍摄细胞在复苏后24、30、48、72、96 h时的生长状态,并根据台盼蓝染色进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。结果:冻存液中的不同血清浓度配比对贴壁细胞短期冻存复苏后的生长形态及增殖无明显影响;而对于悬浮细胞,高血清配比的冻存液(C、D组)短暂冻存后复苏细胞的存活率明显高于低血清配比组(A、B组),并且其生长增殖能力也明显减弱。结论:对于贴壁细胞的短期冻存与复苏,冻存液中DMEM∶FBS∶DMSO比例为8∶1∶1;而对于悬浮细胞的短期冻存与培养,FBS∶DMSO为9∶1的冻存效果最好。

制冷系统吸气管存液弯的不利影响及消除方法

制冷系统现场安装的吸气管道敷设不当容易产生存液弯,不利于系统的安全稳定运行。结合工程经验和相关标准,本文总结了制冷系统管道安装应注意的问题。通过2个典型案例,介绍了由于吸气管道敷设不当引起的储罐罐液位下降和压缩机液击而引起制冷系统故障。通过分析和排查发现事故的原因并进行改造,使两个制冷系统正常运行。

降低空分冷箱存液保冷风险的应对措施

空分装置停车后,采取冷箱存液保冷是空分工艺常用的方法,在恢复开车后可以大大缩短精馏工况调纯时间,但冷箱保冷也存在一定的安全风险。通过系统性分析空分冷箱存液保冷工艺,提出降低风险的具体应对举措,延长冷箱保冷时间,降低冷箱保冷期间的安全风险。

一种无血清冻存液在猪胎儿成纤维细胞上的应用研究

在猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFF)冻存过程中,血清品质常常制约着细胞的冻存效果。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种无血清冻存液应用于猪胎儿成纤维细胞冻存。用3种不同冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞,每种冻存10管。冻存30 d后复苏细胞,测定冻存细胞存活率,细胞增殖活力以及电转后细胞活性。结果显示:自制无血清细胞冻存液,冻存猪胎儿成纤维细胞后存活率达95.33%;细胞增殖活力以及电转后细胞活性均显著高于标准胎牛血清冻存液(p<0.05),与特级胎牛血清冻存液效果相当(p>0.05)。因此,自制冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞效果稳定,能够替代含血清冻存液,有良好的推广应用前景。

长春西汀注射液与复方磷酸氢钾注射液存在配伍禁忌

2010年10月，我们在临床药物配制过程中发现长春西汀注射液与复方磷酸氢钾注射液混合后注射器内出现乳白色浑浊。为进一步验证两药之间是否存在配伍禁忌，我们进行了以下试验：以1ml注射器先后抽取长春西汀注射液及复方磷酸氢钾注射液各0．1ml，结果注射器内液体立刻呈现乳白色混浊，将两种药物抽吸顺序更换后仍出现上述反应，放置1、24h后仍可见乳白色混浊，经摇荡不能消除。

碳酸氢钠注射液与盐酸昂丹司琼注射液存在配伍禁忌

我科于2010年4月收治1例淋巴瘤的病人，在治疗过程中出现碳酸氢钠注射液与盐酸昂丹司琼注射液存在配伍禁忌，现报道如下。

注射用丹参多酚酸盐与盐酸普罗帕酮注射液存在配伍禁忌

注射用丹参多酚酸盐在临床上常用于活血、化瘀、通脉,适用于冠心病稳定型心绞痛患者的治疗。但在临床输液过程中,发现该药与盐酸普罗帕酮注射液同时使用输液管内出现白色混浊。为确保用药安全,笔者进行了相关实验,现报道如下。