柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因NpSWP1的克隆及序列分析与原核表达

微孢子虫孢壁蛋白在侵染宿主的过程中发挥着重要作用。从已构建的柞蚕微孢子虫cDNA文库中筛选出一条孢壁蛋白基因的EST序列,并结合柞蚕微孢子虫感染柞蚕中肠的转录组数据设计特异性引物进行RT-PCR和3'-RACE扩增,克隆得到了一个柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因。该基因ORF长837 bp,编码278个氨基酸,蛋白质分子质量32.02 kD,等电点(pI)7.02。通过Blast比对分析,该基因与家蚕微孢子虫孢子内壁蛋白基因NbSWP1(GenBank登录号:EOB12097.1)的序列相似度为85%,二者编码的氨基酸序列相似度达79%,将该基因命名为NpSWP1(GenBank登录号:KJ573111),初步推测NpSWP1是一种孢子内壁蛋白。将NpSWP1基因与原核表达载体pEASY-E1连接,构建原核表达重组质粒并转化Transetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导5 h后,SDS-PAGE和Western blot检测重组菌液能够产生与预期结果相近的大小约32 kD的目的融合蛋白。研究结果有利于进一步开展NpSWP1的细胞定位和功能研究。

家蚕微孢子虫SWP25基因BmN细胞表达质粒的构建及表达

本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,转化BmDH10Bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。

虾肝肠胞虫4个孢壁蛋白基因的鉴定、序列特征及表达分析

对上海某养殖场凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)开展了虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)检测,发现部分对虾存在EHP感染。随后对EHP感染阳性对虾肝胰腺组织进行转录组测序和数据分析,从中筛选到4个孢壁蛋白基因,分别命名为EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26。获取并比较4个基因cDNA序列和基因组序列,发现这4个基因均不含内含子;进一步比较氨基酸序列,发现这4个基因编码的氨基酸序列相似性很低,但它们分别与泰国当地EHP相应的4个假设孢壁蛋白氨基酸序列一致,提示上海本地EHP与泰国当地EHP很可能属于同一个种。qRT-PCR实验结果显示,这4个孢壁蛋白基因均在肝胰腺中表达量最高,并且EhSWP12表达量显著高于其他3个基因(P<0.05)。研究结果表明,EHP主要感染肝胰腺,EhSWP12是EHP孢壁蛋白中的主要结构蛋白组分。鉴定了EHP的4个孢壁蛋白基因,并明确其序列特征及表达情况,研究结果可为EHP生物学特性和侵染机制研究提供基础数据。

柞蚕微孢子虫微管蛋白和孢壁蛋白基因在不同感染时期的表达水平分析

为寻找柞蚕微孢子虫侵染过程中转录水平上适宜的持家基因和侵染基因,采用半定量PCR和荧光定量PCR的方法,在4龄柞蚕添食柞蚕微孢子虫后的3个时间点,对比了α、β和γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35以及NpSWP1基因的表达差异。结果显示:在4龄柞蚕添食柞蚕微孢子虫后4 d和6 d,α-微管蛋白基因呈现显著升高趋势,孢壁蛋白NpSWP35基因也呈现显著或者极显著升高趋势;确定柞蚕微孢子虫侵染相关基因检测的初始时间为添食后4 d。经过几种基因的表达差异对比分析认为,α-微管蛋白基因可作为柞蚕微孢子虫转录水平研究的持家基因,孢壁蛋白NpSWP35基因可作为浸染检测基因,这些结果可为进一步研究柞蚕微孢子虫的侵染机理提供参考。