申克孢子丝菌菌丝相至酵母相转化的实验研究

目的观察申克孢子丝菌菌丝相向酵母相转化的形态学变化并初步研究连续传代后菌株转化为酵母相的百分率。方法将95株申克孢子丝菌临床株于脑心浸液琼脂培养基上连续传代至酵母相,利用显微镜及血细胞计数板计数菌丝和孢子比例并记录显微镜下形态。结果 95株申克孢子丝菌中,经1次传代即成功转化有23株,经2次传代有14株,经3次传代有10株,经4次传代有6株,4次传代后总计55.8%实验菌株转化为酵母相。结论部分申克孢子丝菌由菌丝相向酵母相转化需经过连续多次传代,连续传代增加了菌丝相至酵母相的转化率。

皮肤型孢子丝菌病585例临床分析

目的对近3年吉林地区585例皮肤型孢子丝菌病病例进行总结，分析其临床和流行病学特征。方法对2007-2009年我院皮肤科确诊的孢子丝菌病病例进行回顾性分析。结果585例患者中男女比1：1．35，平均年龄40．5岁，发病年龄以51～60岁最多见（22．05％）；平均病程6．78个月；冬春季节发病者所占百分比最高；居住于农村者551例（94．19％），有外伤史者占25．47％。临床表现以固定型最常见（56．58％），其次为淋巴管型（39．66％），皮肤播散型和不确定型各占1．88％。受累部位以四肢（50．94％）及面部（43．76％）最多。治疗采用10％碘化钾溶液、伊曲康唑、特比萘芬或联合治疗。失访250例，余335例已治愈289例，平均疗程2．09个月，其余46例仍在治疗随访中。结论孢子丝菌病近年来仍然是吉林地区的多发病，其临床及流行病学特点与以往报道相似，但中老年患者所占比例及皮损不典型病例增加，碘化钾、伊曲康唑和特比萘芬是治疗孢子丝菌病安全有效的药物。

利用核糖体基因进行申克孢子丝菌基因分型

目的利用探针与DNA印迹法对申克孢子丝菌进行种内分型,探讨其基因型特征与菌种来源及临床表现的关系。方法CTAB法提取来源于不同地区31株孢子丝菌临床分离株及1株标准株的基因组DNA,以真菌通用引物ITS4、NS5扩增标准株的rDNA序列作为探针,与经限制性内切酶ApaI酶切后的基因组DNA进行印迹杂交。结果杂交后形成多种清晰而稳定的带型,根据带型将31株孢子丝菌分为15种基因型(A-O型),其中A、B、C三型占51.61%。结论探针与DNA印迹法是孢子丝菌种内分型较为敏感而可靠的方法,该方法所分基因型的不同与菌种的地区来源及临床表现有一定的相关性。

申克孢子丝菌酵母相与白念珠菌诱导中性粒细胞活性氧簇的差异性表达

目的研究人中性粒细胞吞噬申克孢子丝菌酵母相和白念珠菌后胞内活性氧簇（ROS）的实时表达水平及对两者杀菌能力的差异。方法应用密度梯度离心法分离人外周血中性粒细胞，并通过ROS探针（DCFH—DA）、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测申克孢子丝菌酵母相临床株和白念珠菌标准株ATCC90028作用后，中性粒细胞内ROS的实时表达水平及对上述2种真菌孢子的杀菌率。结果申克孢子丝菌酵母相临床株和白念珠菌标准株ATCC90028作用中性粒细胞60min后，申克孢子丝菌组中性粒细胞内ROS表达水平达到峰值（平均荧光强度159．67±11．34），并显著高于白念珠菌组（112．22±9．66），经LSD—t检验，P〈0．01；而作用120～180min后，胞内ROS表达水平（120min为89．01±9．81；180min为57．63±8．46）迅速下降，显著低于白念珠菌组中ROS的同期表达水平（120min时为110．25±7．28；180min时为109．98±9．00，经LSD—t检验，120min时P〈0．05，180min时P〈0．01）。激光共聚焦显微镜观察到，ROS主要表达于吞噬上述真菌孢子的中性粒细胞中，并被募集到被吞噬的部分孢子表面。中性粒细胞对申克孢子丝菌180min杀菌率（19．21％±3．68％）亦显著低于其对白念珠菌孢子的杀菌率（26．63％±4．97％），经LSD—t检验，P〈0．01。结论中性粒细胞吞噬上述2种真菌孢子后，胞内ROS呈明显的差异性表达。与白念珠菌相比，中性粒细胞内ROS水平的迅速下降在一定程度上抑制了其对申克孢子丝菌的杀伤效能。

孢子丝菌病病理组织内病原体的观察

对８２例皮肤孢子丝菌病病理组织内的病原体做了观察，结果ＨＥ染色发现星状体２２例（２６．８％）、孢子３６例（４３．９％）。４５例ＰＡＳ染色发现星状体９例（２０％），孢子３８例（８４．４％），菌丝２例。５例多菌组织块透射电镜观察均见到孢子，并发现一个芽生孢子被中性粒细胞伪足钳住将被吞噬状。４例免疫荧光抗体染色均见到孢子。４５例组织液涂片革兰染色及ＰＡＳ染色发现孢子４０例（８８．８％）、星状体１例（２．２％）。５例扫描电镜观察见到各种形态孢子，１６例免疫荧光染色均见到孢子。真菌培养５２例中４７例（９０％）证实为申克孢子丝菌。孢子丝菌素皮试３８例均阳性。

四对孢子丝菌引物的特异性和敏感性评价

目的筛选对孢子丝菌特异且敏感的引物。方法以50株不同地区来源的孢子丝菌临床分离株及标准株的基因组DNA作为研究样本，以毛霉、烟曲霉、念珠菌临床分离菌株基因组DNA作为对照，通过特异引物PCR扩增的方法筛选国内外文献中报道的4对孢子丝菌引物。所有受试孢子丝菌菌株均出现同一扩增产物，而对照菌株未出现者记为特异性引物，随后将基因组DNA模板倍比稀释后依次行PCR扩增，记录各引物出现阳性扩增结果时的最小模板浓度，检测敏感性。结果在相同PCR条件下，引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有较好特异性，而引物SS3-SS4对孢子丝菌及念珠菌菌株均可扩增出同样大小的PCR产物。引物S2-R2的敏感性最好，基因组DNA模板浓度为5pg／μL时即可被检出。结论针对几丁质合成酶1基因的引物S2-R2为孢子丝菌特异且敏感的引物。

小鼠实验性孢子丝菌感染皮损中病原体的形态

接种孢子丝菌于小鼠皮内造成实验性皮损，用多种方法研究病理组织内菌的形态学特点及变 化。确认ＨＥ染色标本中孢子周围有一环状不着色晕。组织内该菌的凝集素结合形式与其培养相同而有 别于多种其他深部真菌。发现半薄切片能更清晰地显示菌体形态及其与宿主细胞的关系。在宿主细胞免 疫低下时菌丝可存活并生长繁殖。

Toll样受体2和4在抗孢子丝菌早期免疫阶段小鼠皮肤中的表达

目的探讨小鼠皮肤Toll样受体（TLR）2和TLR4在抗孢子丝菌早期免疫阶段的表达。方法实时荧光定量PCR检测BALB／c小鼠皮肤早期免疫阶段的TLR2和TLR4mRNA表达水平，同时通过免疫组化检测两者蛋白表达水平。结果孢子丝菌分生孢子接种小鼠皮肤后，TLR2mRNA转录水平在6h后逐渐升高至对照组的18．8倍，24h达高峰，为对照组的34倍；TLR4mRNA转录水平在6h内达高峰，为对照组的56．7倍，此后逐渐下降。免疫组化结果显示，孢子丝菌处理组小鼠皮肤角质形成细胞及巨噬细胞均可表达TLR2和TLR4蛋白，对照组不表达。血清中白细胞介素12及肿瘤坏死因子α在实验组和对照组的表达差异无统计学意义。结论TLR2和TLR4参与了小鼠皮肤角质形成细胞和巨噬细胞对孢子丝菌的识别，有助于免疫防御作用。

“ITS／CAL”靶位分子鉴定结合表型分析确诊狭义申克孢子丝菌致淋巴管型孢子丝菌病一例

患者女，54岁，农民。左上肢近手腕部外伤后出现豌豆大小的单一红色结节15d，后肿大、破溃，并在30d内发展为多个成串状分布的结节。皮肤科检查：患者左上肢可见多个呈线性排列的紫红色结节，质硬；部分结节破溃，伴少许脓性分泌物。组织病理提示，感染灶呈混合炎性细胞浸润为主的化脓性肉芽肿炎症；过碘酸雪夫染色阴性，未见真菌孢子、菌丝及星状体。活检组织真菌培养阳性。根据培养物形态学分析和内部转录间隔区（ITS）及钙调蛋白（CAL）编码区靶位的分子生物学鉴定结果，确诊该病例为狭义申克孢子丝菌致淋巴管型孢子丝菌病。给予患者10％碘化钾溶液10ml／次每日3次口服；治疗2个月后，患者自觉症状明显改善，后失访。本例报道提示联合应用表型鉴定和“ITS／CAL”靶位的基因分析能够准确将孢子丝菌复合体鉴定到种水平。

孢子丝菌病研究进展

世界卫生组织将孢子丝菌病归为"被忽视的热带病",近年来对孢子丝菌病相关的研究逐渐增多,本文从病原体、流行病学、诊断、治疗、疫苗这五个方面综述孢子丝菌病的近期研究进展。

以S2-R2为引物PCR检测石蜡切片中的孢子丝菌

目的探讨应用特异性引物PCR方法检测石蜡切片中孢子丝菌的可行性。方法选取30份大连及10份长春地区临床疑诊孢子丝菌病的石蜡切片标本，采用改良的微波脱蜡、液氮研磨-CTAB破壁法提取DNA，以特异性引物S2-R2进行PCR扩增，与真菌培养结果进行比对。结果30份大连地区标本中22份见阳性PCR扩增产物（73．33％）。真菌培养阳性的22份标本中20份PCR出现阳性扩增产物（91％），真菌培养阴性的8份标本中2份PCR出现阳性扩增产物。10份长春地区标本7份见阳性PCR扩增产物（70％）。结论以S2-R2为引物的PCR适用于孢子丝菌病石蜡切片中病原菌的检测。

孢子丝菌病药敏和治疗进展

孢子丝菌病是一种深部真菌病，其致病菌申克孢子丝菌为一种双相真菌，双相真菌的体外药敏试验至今仍无统一标准。饱和碘化钾溶液、伊曲康唑、特比萘芬为治疗孢子丝菌病的常用药物，临床中选择合适的抗真菌药物对治疗此病具有重要意义。体外药敏试验是评价抗真菌药物活性的重要方法，也是选择药物的依据之一。

申克孢子丝菌酵母相对人THP-1巨噬细胞样细胞p38MAPK激活及白细胞介素6表达的影响

目的 探讨申克孢子丝菌酵母相对人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）巨噬细胞样细胞p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活化及白细胞介素6（IL-6）表达的影响。方法 实时荧光定量反转录PCR分析申克孢子丝菌酵母相刺激THP-1巨噬细胞样细胞3、6 h后IL-6 mRNA表达水平变化，酶联免疫吸附法检测刺激24 h后IL-6分泌量；Western印迹法分析2 × 106 CFU/ml申克孢子丝菌酵母相体外作用于THP-1巨噬细胞样细胞30 min和60 min后p38MAPK磷酸化水平的变化，同时检测100 nmol/L地塞米松（p38MAPK抑制剂）预处理THP-1巨噬细胞样细胞30 min后p38MAPK磷酸化水平及IL-6 mRNA表达水平的变化。采用SPSS19.0统计软件，进行多因素方差分析、单因素方差分析，组间多重比较采用LSD检验。结果 刺激THP-1巨噬细胞样细胞3 h后，酵母相组、凝胶多糖组、空白对照组IL-6 mRNA表达水平分别为56.81 ± 7.36、26.69 ± 1.22、0.97 ± 0.05，刺激6 h后分别为378.03 ± 16.67、276.24 ± 39.13、1.02 ± 0.04，组间差异有统计学意义（F = 5 552.22，P 〈 0.001）。申克孢子丝菌酵母相刺激6 h后IL-6 mRNA表达高于刺激3 h后（q = 16.74，P 〈 0.001），申克孢子丝菌酵母相与THP-1巨噬细胞样细胞共孵育24 h后，酵母相组、凝胶多糖组及空白组细胞上清液中IL-6浓度分别为（59.96 ± 18.16）、（91.01 ± 17.27）、（5.50 ± 2.30） pg/L，组间差异有统计学意义（F = 26.62，P 〈 0.01）；酵母相组高于空白对照组（P 〈 0.01）。地塞米松处理后，酵母相组IL-6 mRNA表达水平（4.46 ± 1.03）低于未用地塞米松处理组（493.52 ± 113.87，P 〈 0.001）。申克孢子丝菌酵母相作用THP-1巨噬细胞样细胞30、60 min后，磷酸化p38MAPK蛋白相对表达量均高于空白对照组（P 〈 0.01）。地塞米松预处理THP-1巨噬细胞样细胞后，磷酸化p38MAPK水平低于未用地塞米松处理组，差异有统计学意义（q = 10.81，P 〈 0.01）。结论 人THP-1巨噬细胞样细胞体外与申克孢子丝菌酵母相作用后，通过激活p38MAPK信号通路促进IL-6表达。

PCR结合基因扫描分析技术对几种深部真菌病致病菌的快速检测及鉴定

目的用PCR法快速鉴定22种(23株)深部真菌病致病菌种。方法应用荧光标记的真菌通用引物ITS4与ITS86对22种(23株)深部真菌病致病菌种的菌悬液进行PCR扩增,扩增产物经ABIPRISMTM377测序仪及基因扫描分析软件精确测定片段大小,与对照组———相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果①17种致病菌种菌悬液经ITS4、ITS86扩增出单一的片段(除了构巢曲霉和黑曲霉、白念珠菌和类星形念珠菌、裴氏着色真菌和皮炎外瓶霉片段长度相同)。②菌悬液扩增片段的扫描分析结果与其DNA扩增结果相近,差异无显著性。③整个检定过程仅需6h。结论采用ITS通用引物及菌悬液PCR检测法,结合基因扫描分析技术可准确、特异、快速、敏感地检测并鉴定出22种深部真菌病致病菌种,这将有望成为快速诊断深部真菌病的一种方法。