阿维链霉菌孢子色素生物合成对阿维菌素产量的影响

以野生型阿维链霉菌NRRL8165为出发菌株,用PCR方法克隆孢子色素基因簇直系同源基因(whiEa)侧翼片段,并构建基因置换载体pHL643。将pHL643跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,通过置换载体和染色体之间的同源双交换,对染色体上的whiEa基因簇进行置换,得到3株阿泊拉霉素抗性、硫链丝菌素敏感的重组菌株,均表现为孢子色素合成缺陷。通过Southern杂交分析,证明whiEa基因簇被置换。通过摇瓶发酵和HPLC检测,发现whiEa基因簇置换菌株所产阿维菌素产量明显提高,表明孢子色素与阿维菌素生物合成之间可能有竞争底物的现象。

麦迪霉素产生菌中与孢子色素聚酮体生物合成相关的酮基还原酶基因

研究了麦迪霉素产生菌-生米卡链霉菌1748的原生质体形成、再生和DNA转化条件,建立了生米卡链霉菌1748的DNA转化系统.麦迪霉素产生菌酮基还原酶(MKR)基因利用大肠杆菌-链霉菌穿梭温敏型质粒pKCll39(Am^R)进行基因中断实验,结果表明了发生同源交换的重组子在含Am的MY培养基上形成白色孢子,而生米卡链霉菌1748在MY培养基上形成灰色孢子.以MKR基因为探针的South-ern杂交结果证明重组子中确实发生了同源交换,发生了基因中断的重组子仍然产生麦迪霉素.这一结果证明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的生物功能是参与麦迪霉素产生菌中决定孢子色素的聚酮体的生物合成,与麦迪霉素的生物合成无关.重组质粒pCN8B12来自麦迪霉素产生菌基因文库,是以pNJ1为载体,插入了28kbDNA片段,该片段中既有与actⅠ同源的区域也有与actⅢ同源的区域.

黄曲霉分生孢子色素合成基因pks1的鉴定及其对生长发育和侵染性的影响

【目的】分生孢子色素是真菌细胞壁的重要成分,对真菌的生长发育极为重要,并有助于真菌抵御各种环境胁迫。本研究鉴定了黄曲霉分生孢子色素合成基因,并研究了分生孢子色素对黄曲霉生长发育及其对抗紫外照射和侵染能力的影响。【方法】通过已知真菌孢子色素合成基因蛋白序列同源比对确定了黄曲霉分生孢子色素合成基因及其所在的基因簇,利用同源重组策略对目标基因进行敲除,获得了该色素合成基因缺失的突变菌株,并研究该基因敲除后对表型、产孢、菌核形成、黄曲霉毒素产生、抗紫外照射和侵染性等影响。【结果】与野生型菌株相比,黄曲霉pks1基因缺失菌株的分生孢子颜色变为白色,生长速度、孢子产量、菌核形成和黄曲霉毒素B_1的产生均没有显著性变化,但该基因的缺失导致孢子对紫外线照射的抵御能力明显减弱,降低了黄曲霉对玉米和花生种子的侵染能力。【结论】pks1(AFLA_006170)基因是黄曲霉分生孢子色素合成的关键基因,影响黄曲霉分生孢子对紫外线照射等不利环境因子的抵抗能力和对粮食种子的侵染能力。

Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中孢子色素合成基因簇(sah)的鉴定

【目的】Streptomyces sahachiroi ATCC 33158全基因组测序后,通过生物信息学分析找到一个II型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因簇sah。我们通过基因敲除和异源表达的方法对sah的生物学功能进行了研究。【方法和结果】对sah基因簇ORF(open reading frame)进行分析后发现,除了一个额外的氧甲基转移酶基因sahI以外,该基因簇与天蓝色链霉菌中负责孢子色素合成的基因簇whiE具有很高的相似性。将sah中负责后修饰的3个基因sahG、sahH和sahI分别敲除后,发现孢子色素的颜色随之发生明显的变化。将sah-minimal PKS基因和whiE-minimal PKS基因分别导入变铅青链霉菌ZX1中进行异源表达,高效液相色谱及液质联用分析证实它们产生相同的水溶性红色色素物质。【结论】sah与whiE基因簇具有相似的生物学功能,负责链霉菌孢子色素的合成。这两个基因簇所合成的孢子色素具有相同的母核,差别在于sah基因簇中多了一个编码氧甲基转移酶的后修饰基因,这可能是导致两种链霉菌孢子在颜色上有细微差别的原因。

天蓝色链霉菌孢子色素whiE在大肠杆菌中的异源生物合成

【目的】在大肠杆菌中完整重构孢子色素whiE的生物合成途径,分离纯化表达体系中合成的新化合物,并解析whiE的生物合成途径。【方法】构建whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI的单基因重组质粒,SDS-PAGE检测蛋白表达情况;借助Xba I与Spe I互为同尾酶的特性,实现多基因组合串联;构建好的重组质粒再导入大肠杆菌菌株BAP1中进行异源表达,并用高效液相色谱(HPLC)检测发酵产物;依次使用正相硅胶柱和反向半制备柱分离发酵产物,四级杆飞行时间质谱仪(Q-TOFMS)鉴定发酵产物分子量。【结果】whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI均获得可溶性表达;这3个基因单个串联到菌株BTw95中均未检测到新的产物生成;而whiE-ORFII和whiE-ORFVII、whiE-ORFI和whiE-ORFVII双基因组合以及三基因组合串联到BTw95中可检测得到两种化合物ZYC-1和ZYC-2。在负离子模式下进行Q-TOFMS检测,ZYC-1的[M-H]-为419.0748,推测分子式为C_(23)H_(16)O_(8);ZYC-2的[M-H]-为465.0743,推测分子式为C_(24)H_(18)O_(10)。【结论】本研究推进了孢子色素whiE生物合成途径在大肠杆菌中的异源重构,分离鉴定了2个十二酮II型聚酮化合物,并推测了孢子色素whiE的生物合成途径。

Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中Ⅱ型聚酮合酶基因sahA的功能分析

以酮基合酶基因KSa的简并性引物对Streptomyces sahachiroi基因组进行扩增,发现除了已知的阿嗪霉素B生物合成基因簇以外,还存在一个潜在的聚酮合酶(PKS)基因sahA。对sahA编码的氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,结果表明,sahA属于Ⅱ型聚酮合酶基因家族,与合成孢子色素的基因亲缘关系较近。通过单交换中断sahA基因后,链霉菌孢子的颜色由铅灰色变为白色,而产孢时间、孢子的产量以及其抗紫外线的能力都没有变化,对抗生素阿嗪霉素B的产量也没有影响。初步证实这个潜在的Ⅱ型聚酮合酶基因sahA很可能与S.sahachiroi孢子色素的生物合成有关。