宁夏地区奶牛源隐孢子虫分子鉴定与分析

为了明确宁夏地区奶牛隐孢子虫的流行情况及其优势基因型,采集宁夏4个地区10个规模化奶牛养殖场中1174份奶牛粪便样品,基于核糖体小亚基RNA(SSU rRNA)基因通过套式PCR进行检测和分析。结果显示,宁夏地区奶牛隐孢子虫阳性率为28.5%(335/1174);共鉴定出4种虫种,即微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫,阳性率分别为40.6%(136/335)、36.1%(121/335)、19.4%(65/335)和3.9%(13/335);微小隐孢子虫共鉴定出4种基因亚型,分别为ⅡdA15G1(n=70)、ⅡdA18G1(n=26)、ⅡdA19G1(n=23)和ⅡdA20G1(n=17)。统计学分析显示,在宁夏地区,0~2月龄的犊牛隐孢子虫感染率最高,且奶牛隐孢子虫的感染率与月龄差异显著相关(P<0.001)。表明宁夏地区奶牛存在隐孢子虫感染且存在人畜共患虫种,ⅡdA15G1微小隐孢子虫是宁夏地区奶牛感染的优势亚型。

昌吉州牛隐孢子虫流行病学调查与防控

隐孢子虫病(Cryptosporidium,sp)是由隐孢子虫引起的一种以腹泻为主要特征的人畜共患的肠道寄生原虫病,该病不仅严重危害了牛养殖业的经济效益,并且患病牛也成为人患隐孢子虫病的重要传染源。因此,本研究针对新疆昌吉州辖区肉牛规模化养殖场内不同生长阶段且具有腹泻、弱犊、营养不良、腹痛、厌食等临床表现的病牛,通过问卷调查和实验室检测等方式开展流行病学调查,以期为肉牛规模化养殖场犊牛隐孢子虫感染制定科学合理的生物安全防控措施提供依据。

东方蜜蜂微孢子虫腺苷酸激酶的生物信息学与基因表达特征

本研究旨在解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的腺苷酸激酶(Adenylat kinase,ADK)NcADK的理化性质和分子特性,并检测NcADK基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中的表达特征,以期丰富NcADK相关信息,并为进一步的功能研究提供依据。利用相关生物信息学软件预测和分析NcADK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件和Batch CD-Search工具分别预测东方蜜蜂微孢子虫和其它7种微孢子ADK蛋白的保守基序和保守结构域。通过Mega 11.0软件基于ADK氨基酸序列构建进化树。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中NcADK的相对表达量。结果表明,NcADK的CDS含有540个核苷酸,可编码179个氨基酸;NcADK的分子量约为20.66 kDa,分子式为C903H1488N258O278S8,脂肪系数为100.61,平均亲水系数为-0.502,等电点为6.83,含29个负电荷氨基酸和29个正电荷氨基酸;NcADK可同时定位于细胞质、线粒体、细胞核、囊泡和过氧化物酶体;NcADK含20个磷酸化位点,不含典型的信号肽;NcADK含88个α-螺旋,24条延长链,17个β-转角,50个无规则卷曲,与模板A0A0F9WEU7.1.A之间的序列同源性为100%;在东方蜜蜂微孢子虫、东方赤孢子虫Hamiltosporidium tvaerminnensis、肠脑炎微孢子虫Encephalitozoon intestinalis、按蚊微孢子虫Anncaliia algerae和角膜条孢虫Vittaforma corneae ADK中均鉴定到1个相同的结构域和5个相同的保守基序;东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫Nosema apis的ADK在进化树上聚为一支。相较于接种后1 d(1 day post inoculation,1 dpi),NcADK的表达量在2 dpi上调但无显著差异(P>0.05),在3 dpi和4 dpi均显著上调(P>0.05)。研究结果明确了NcADK的理化性质和分子特性,并揭示NcADK是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,不同微孢子虫的ADK具有较强的保守性,东方蜜蜂微孢子虫及其姐妹种蜜蜂微孢子虫的ADK具有高同源性,NcADK在3 dpi和4 dpi被激活表达。

狐源兔脑炎微孢子虫极管蛋白2(PTP2)的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立一种特异性好、敏感性高、重复性好的可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,试验首先从疑似感染兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon.cuniculi)的蓝狐脑组织DNA中扩增PTP2基因,并将其与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET32a-PTP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,将菌体超声后对表达的重组蛋白进行可溶性分析,并纯化目的蛋白;然后以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件和临界值的确定建立蓝狐兔脑炎微孢子虫的间接ELISA方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验;最后采用建立的间接ELISA方法对28份经常规PCR方法验证已经感染兔脑炎微孢子虫病的蓝狐血清样品进行检测,并计算符合率。结果表明:表达的重组蛋白的分子质量为45.8 ku,且表达产物以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,经纯化杂带明显减少,纯化后的重组蛋白质量浓度为1.55 mg/mL。间接ELISA方法的最佳包被抗原质量浓度为8μg/ml,最佳一抗稀释度为1∶100,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳封闭条件为37℃、1 h,最佳一抗孵育时间为120 min,最佳二抗稀释度为1∶5 000,最佳二抗孵育时间为60 min,最佳显色时间为20 min。阴、阳性血清OD_(450)临界值分别为0.268和0.302。建立的间接ELISA方法检测蓝狐犬瘟热病毒、蓝狐伪狂犬病毒、蓝狐细小病毒阳性血清均为阴性,可检测到稀释度为1∶3 200的蓝狐兔脑炎微孢子虫阳性血清,批内重复与批间重复变异系数均小于10%。用建立的间接ELISA方法检测28份蓝狐血清样品的阳性样品数为23份,与常规PCR方法的符合率为82.14%。说明试验成功建立了一种可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,该方法特异性好、敏感性高、重复性好,适合在基层推广。

云南蚕区家蚕微孢子虫遗传多样性分析

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是蚕业生产上一种重要病害——微粒子病的病原体。探讨家蚕微孢子虫种内的遗传多样性,可为云南蚕区家蚕微粒子病的防控提供参考依据。从云南省不同养蚕地区收集了感染微孢子虫的病蚕样品,分离纯化家蚕微孢子虫并提取基因组,克隆SSU rDNA(small subunit ribosomal DNA)和ITS(internal transcribed spacer)序列并进行生物信息学分析。结果发现,云南蚕区Nosema bombycis分离株SSU rDNA序列同源性高达99%以上,遗传距离小于0.006,它们在长度和多个位点存在差异,呈现不同程度的多态性;ITS遗传差异较为显著,序列中存在多碱基的插入或缺失、单碱基的转换和颠换。基于SSU rDNA和rDNA-ITS序列构建系统发生树,结果显示,云南蚕区家蚕微孢子虫分离株系间存在遗传分化,种群间亲缘关系与地理位置无直接联系。研究结果丰富了云南蚕区家蚕微孢子虫的种内遗传多样性。

福建省部分规模化畜禽场隐孢子虫感染情况调查

为了解福建省规模化畜禽场隐孢子虫感染情况,对10个规模化畜禽场(牛场、猪场、羊场、鸡场、鸭场各2个)100份粪样采用隐孢子虫通用引物进行荧光定量PCR检测,结果相应牛场、猪场、羊场、鸡场、鸭场的隐孢子虫平均检出率分别为60.0%、45.0%、42.1%、42.9%和15.0%。该结果可为福建省规模化畜禽场的隐孢子虫防控及保障公共卫生安全提供参考。

一例牛隐孢子虫病的诊疗体会

该文介绍一例犊牛顽固性腹泻,经检查诊断为牛隐孢子虫病,采用相应治疗措施后,取得较好效果。

隐孢子虫病的流行现状

隐孢子虫病是由隐孢子虫(Cryptosporidium)寄生于人类、家养动物及多种野生动物胃肠道引起的一种严重的人畜共患胃肠疾病。该病不但威胁人类健康,亦严重影响畜牧业发展。近年来随着研究的深入,隐孢子虫的流行表现出许多新的特点,危害远远超出了人们的估计。这些特点主要表现在:感染家畜,增加人类感染风险;与动物其他病原混合感染危害加重;感染野生动物,具有自然疫源性;感染海洋和水生动物,造成水体污染;经水源和食物传播引起人类群体感染;暴发感染对人群危害严重。深入开展隐孢子虫病流行病及防控研究对提高公共卫生水平具有重要意义。

牛隐孢子虫病研究进展与综合防控

牛隐孢子虫病是由牛感染隐孢子虫诱发的一种寄生性原虫病,患病后牛会表现出腹泻、厌食等症状,制约牛的生长发育,严重时可造成死亡。随着养牛业的发展,养殖规模进一步扩大,但存在牛隐孢子虫病高发的情况,疾病在各大养殖场流行,逐渐成为影响新生犊牛最常见的疾病之一,引起了更多养殖人员和防疫人员的重视。当前,在养殖过程中,应加强疾病防控,促进养殖工作有序展开。

甘肃某牛场隐孢子虫引起犊牛腹泻的虫种鉴定及亚型分析

新生犊牛腹泻(NCD)严重影响犊牛的健康,给养殖业造成巨大的经济损失。隐孢子虫病是引起NCD的重要原因之一,但是由隐孢子虫引起的NCD疾病暴发的报道还非常少。2022年9月,甘肃省武威市某奶牛场1月龄以内犊牛发生严重腹泻,并伴有部分犊牛死亡。为弄清犊牛腹泻是否由隐孢子虫引起,本研究对该牛场1月龄以内腹泻和非腹泻犊牛分别采集10份样品,应用显微镜检和套氏PCR方法对犊牛粪便样品进行了检测。结果显示,应用显微镜检方法检出10份隐孢子虫阳性样品;应用PCR方法检出14份阳性样品,包括8份腹泻样品和6份非腹泻样品。PCR方法隐孢子虫总的感染率为70.0%,其中腹泻犊牛的感染率为80.0%,非腹泻犊牛的感染率为60.0%。对所有PCR阳性样品进行测序分析,均为微小隐孢子虫。进一步对14份C.parvum阳性样品进行gp60基因扩增和亚型鉴定,13份样品测序成功,均为IIdA19G1亚型。本研究首次在甘肃省发现隐孢子虫引起犊牛腹泻的暴发,研究结果对深入了解该地区犊牛腹泻的病因,做好腹泻疾病的精准防控具有重要意义。

东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-11248及其靶基因SGT1的生物信息学和表达谱研究

【目的】对前期鉴定所获得的东方蜜蜂微孢子虫的nce-miR-11248进行表达和序列验证,预测、分析其靶基因,并检测nce-miR-11248及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达谱,为进一步开展nce-miR-11248调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能及作用机制研究提供参考。【方法】利用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-11248的真实性;利用相关生物信息学软件预测nce-miR-11248的靶基因,并分析其编码蛋白的分子特性;使用MEME和TBtools软件预测SGT1蛋白的保守基序和结构域,通过Mega 11.0软件进行氨基酸序列多重比对,采用邻接法构建系统进化树。采集东方蜜蜂微孢子虫孢子侵染1,2,4,6和8 d的意蜂工蜂中肠组织,采用RT-qPCR检测nce-miR-11248及其靶基因SGT1的表达谱。【结果】nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在,其序列长度为25 bp。nce-miR-11248的靶基因为SGT1。SGT1蛋白分子式为C_(765)H_(1213)N_(195)O_(241)S_(4),分子质量约为17.10 ku,脂溶系数为82.67,等电点为5.50,亲水系数为-0.709,不含典型的信号肽和跨膜结构域,可同时定位于细胞核、线粒体和过氧化物酶体。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、泛胞虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1中均含有4个保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4)和1个结构域(SGT1超家族结构域)。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1聚为一支,且东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1进化距离最近。相较于侵染东方蜜蜂微孢子虫后1 d,侵染后2,4,6和8 d nce-miR-11248的表达量均显著下调(P<0.05);侵染后2,4,6和8 d SGT1的表达量均下调,其中侵染后4,6和8 d的表达量与2 d的差异达显著水平(P<0.05)。【结论】nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在;东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1亲缘关系最近;随着侵染时间的延长,nce-miR-11248及其靶基因SGT1在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达量均呈持续下降;nce-miR-11248和SGT1是潜在的参与调控微孢子虫侵染过程的因子。

新孢子虫硫氧还蛋白的生物信息学分析及其原核表达的鉴定

为研究新孢子虫硫氧还蛋白(Trx)的生物学特性,本研究利用PCR扩增犬新孢子虫Trx(NcTrx)基因的编码区序列,构建pET-32a(+)-NcTrx原核表达载体,经双酶切与测序鉴定正确后,利用系列生物信息学软件分析NcTrx基因及其编码氨基酸序列的生物信息学特征,并对其蛋白互作网络中排名前100的蛋白进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析。重组质粒中NcTrx基因的测序结果显示,NcTrx基因片段为1 287 bp,编码428个氨基酸;该蛋白含1个信号肽,1个跨膜区,主要位于内质网上;NcTrx蛋白的二、三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲组成,有12个B细胞抗原表位;该蛋白属于硫氧还蛋白家族,存在典型的氧化还原基序“-CXXC-”,有38个磷酸化位点、10个O-糖基化位点;与NcTrx蛋白互作最强的为酪氨酸激酶样蛋白,二者通过氢键和静电作用实现相互对接;GO功能及KEGG信号通路的显著性富集分析结果显示,NcTrx与其互作的蛋白主要参与蛋白质转运、蛋白质二硫键异构酶活性等生物学过程,与内质网蛋白质加工、硫代谢等信号通路密切相关。将pET-32a(+)-NcTrx转化BL21(DE3)感受态细胞,并经IPTG诱导表达后采用镍亲和层析法纯化重组NcTrx蛋白(rNcTrx),经SDS-PAGE检测该蛋白的表达及纯化效果,采用Bradford法测定纯化蛋白的浓度。采用western blot鉴定rNcTrx的反应原性。SDS-PAGE结果显示,rNcTrx分子量约66 ku,主要以包涵体的形式表达,且纯化效果较好,浓度为0.8 mg/mL。Western blot检测结果显示,纯化的rNcTrx能够与鼠His MAb、新孢子虫感染的小鼠血清发生特异性反应,在66 ku处出现特异性条带。本研究首次经PCR扩增NcTrx基因,对NcTrx基因及其蛋白进行了生物信息学分析,并经原核系统表达及鉴定了NcTrx蛋白,为后续深入探究该蛋白的生物学功能提供参考依据。

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-15338及候选靶基因的表达谱

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-15338调控东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂的功能及作用机制提供参考和依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-15338的存在和表达。利用相关软件预测nce-miR-15338的靶基因并进行数据库注释。通过RT-qPCR检测nce-miR-15338及其候选靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中的表达谱。【结果】nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达;nce-miR-15338共靶向LCFAL 2和20s PS等16个基因;分别有16、7、8、3个靶基因可注释到Nr、Swiss-Prot、GO和KEGG数据库;相较于接种后1 d,nce-miR-15338的表达量在2 d极显著上调,在4、6、8 d均极显著下调;LCFAL 2的表达量在接种2、4、6、8 d后皆为极显著下调;20s PS在接种2、4、6、8 d的表达水平均为极显著下调。【结论】研究结果证实了nce-miR-15338的真实存在和表达,并明确了东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-15338及其候选靶基因LCFAL 2和20s PS的表达规律。

东方蜜蜂微孢子虫RRDRP的分子特性及系统进化分析

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的Rad18-like重组与DNA修复蛋白(Rad18-like recombination and DNA repair protein,RRDRP)进行系统进化分析,为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】利用Protparam、ProtScale和SWISS-model等软件分析RRDRP的理化性质、亲水性和三级结构。利用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等软件预测RRDRP的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构。使用PSORTⅡ软件预测RRDRP蛋白的亚细胞定位。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种RRDRP的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RRDRP进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建系统进化树。【结果】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP基因含有2928个核苷酸,可编码975个氨基酸,分子质量约11.50 ku,脂溶系数93.58,等电点6.63,分子式C_(5135)H_(8253)N_(1377)O_(1545)S_(34),平均亲水系数为-0.627,可同时定位于细胞核、细胞质、过氧化物酶体和细胞骨架;RRDRP包含55个磷酸化位点、678个α-螺旋、99条延长链、22个β-转角及176个无规则卷曲;RRDRP不含信号肽与跨膜结构域。东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、颗粒病微粒子虫等11个物种的RRDRP中均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)。东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微粒子虫在进化树上聚为一支,同源性较高。【结论】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,在东方蜜蜂微孢子虫以及其他微孢子虫和真菌中高度保守。【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的Rad18-like重组与DNA修复蛋白(Rad18-like recombination and DNA repair protein, RRDRP)进行系统进化分析,为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】利用Protparam、ProtScale和SWISS-model等软件分析RRDRP的理化性质、亲水性和三级结构。利用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等软件预测RRDRP的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构。使用PSORT Ⅱ软件预测RRDRP蛋白的亚细胞定位。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种RRDRP的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RRDRP进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建系统进化树。【结果】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP基因含有2 928个核苷酸,可编码975个氨基酸,分子质量约11.50 ku,脂溶系数93.58,等电点6.63,分子式C5135H8253N1377O1545S34,平均亲水系数为-0.627,可同时定位于细胞核、细胞质、过氧化物酶体和细胞骨架;RRDRP包含55个磷酸化位点、678个α-螺旋、99条延长链、22个β-转角及176个无规则卷曲;RRDRP不含信号肽与跨膜结构域。东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、颗粒病微粒子虫等11个物种的RRDRP中均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)。东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微粒子虫在进化树上聚为一支,同源性较高。【结论】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,在东方蜜蜂微孢子虫以及其他微孢子虫和真菌中高度保守。

家蚕响应微孢子虫感染的可变剪接事件分析

【目的】家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)感染引发的微粒子病是影响蚕业发展的重要病害。为了揭示可变剪接(AS)基因在家蚕响应微孢子虫感染中的作用,对其中肠内的AS事件进行分析。【方法】利用Illumina Hiseq TM 4000测序平台,对健康家蚕(对照组)和被微孢子虫感染的家蚕中肠组织进行转录组测序。使用rMATS软件对样品中的AS事件与差异剪接基因(DSGs)进行鉴定,并对DSGs进行GO富集和KEGG信号通路分析。【结果】在对照组和感染组中分别检测到5346个和4992个AS事件,两组的AS事件类型都以外显子跳跃(SE)事件为主,差异分析发现了25个显著的DSGs。GO富集分析表明,DSGs主要富集在21个条目,其中以细胞过程、物质代谢、结合、催化活性的基因数量较多;KEGG信号通路分析显示,DSGs富集数较多的是信号传导、免疫系统、多糖生物合成与降解、能量代谢等通路。【结论】家蚕中肠组织存在大量AS事件,在微孢子虫感染过程中存在25个DSGs,其功能涉及新陈代谢和细胞免疫等。

犬新孢子虫miRNAs的鉴定与分析

为鉴定犬新孢子虫(Neospora caninum)特异表达的miRNAs,并研究其在宿主细胞中的表达情况,本研究收集N.caninum速殖子感染的山羊子宫内膜上皮细胞(caprine endometrial epithelial cells,EECs)24和48 h的样本,用Illumina高通量测序平台和生物信息学分析犬新孢子虫特异表达的miRNAs及其体外表达情况,并研究了一个上调的miRNA novel3_mature对犬新孢子虫在山羊EECs增殖的影响。结果发现,共鉴定出3404个犬新孢子虫特异表达的miRNAs(155个新预测miRNAs),其中77个(47个上调和30个下调)miRNAs显著差异表达;随机选取7个显著差异表达的miRNAs进行实时荧光定量PCR分析,结果与高通量测序结果一致;预测分析发现61个miRNAs的3978个靶基因,功能富集分析发现这些靶基因可能主要参与MAPK信号通路、突触导向、黏着斑、cMAP信号通路、钙信号通路等;转染novel3_mature的模拟物显著促进犬新孢子虫在山羊EECs中的增殖。犬新孢子虫存在多个特异表达的miRNAs,其在虫体增殖中发挥重要作用,研究成果为深入理解犬新孢子虫胞内生存提供了新的思路。

柯坪县规模化养殖场双峰驼隐孢子虫感染情况调查与种类鉴定

[目的]掌握新疆维吾尔自治区阿克苏地区柯坪县规模化养殖场双峰驼隐孢子虫的感染情况和种类分布情况。[方法]从柯坪县4个乡(镇)6个规模化双峰驼养殖场共收集516份粪便样本,全部提取DNA样本,基于隐孢子虫(Cryptosporidium)SSU rDNA序列进行PCR检测,序列比对分析后进行隐孢子虫种类鉴定;采用χ^(2)检验法比较不同规模化养殖场双峰驼隐孢子虫的感染率差异;将被鉴定为微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.parvum)阳性的DNA样本,基于gp60基因序列进行PCR检测,序列比对分析后进行微小隐孢子虫亚型鉴定。[结果]516份双峰驼粪便DNA样本中检测出34份隐孢子虫阳性,总体感染率为6.59%(34/516),以阿恰勒镇养殖场2的双峰驼隐孢子虫感染率最高,为9.57%(9/94);不同养殖场双峰驼隐孢子虫的感染率统计学差异显著(χ^(2)=5.497,P<0.05)。基于SSU rDNA序列,34条隐孢子虫序列经比对分析,鉴定出3种隐孢子虫,分别为安氏隐孢子虫(n=29)、隐孢子虫大鼠基因型Ⅳ(n=1)和微小隐孢子虫(n=4);基于gp60基因序列,4条微小隐孢子虫序列经比对分析,均鉴定为Ⅰd-like-A21亚型,具有独特的遗传进化特点。[结论]柯坪县双峰驼隐孢子虫感染率较低,其感染的微小隐孢子虫具有独特亚型。研究结果为我国双峰驼源隐孢子虫种类分布特征和遗传进化提供了基础数据。

喀什地区某规模化引种场奶牛感染隐孢子虫的PCR检测与种系发育分析

[目的]掌握新疆维吾尔自治区喀什地区某规模化引种场奶牛的隐孢子虫(Cryptosporidium)感染情况及其种类分布特征。[方法]采集该场不同年龄段奶牛粪便样本190份,基于小亚基核糖体RNA基因(SSU rDNA),采用PCR方法检测隐孢子虫感染情况,经序列比对鉴定隐孢子虫种类。利用卡方(χ^(2))检验法,比较不同年龄段奶牛隐孢子虫感染率的差异。采用PCR方法扩增微小隐孢子虫(C.parvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)和芮氏隐孢子虫(C.ryanae)的gp60基因,经序列比对鉴定3种隐孢子虫的基因亚型,构建种系发育树解析其遗传进化特征。[结果]32份奶牛粪便样本呈隐孢子虫阳性,总体感染率为16.84%(32/190);鉴定出4种隐孢子虫,分别为微小隐孢子虫(n=8)、安氏隐孢子虫(C.andersoni,n=10)、牛隐孢子虫(n=10)和芮氏隐孢子虫(n=4)。以3月龄以下断奶前犊牛的隐孢子虫感染率较高,为28.00%(14/50),不同年龄段奶牛隐孢子虫的感染率差异显著(χ^(2)=8.679,P<0.05)。8份微小隐孢子虫阳性样本成功获得7条gp60基因亚型序列,鉴定出2种亚型,分别为ⅡdA15G1亚型(n=3)和ⅡdA19G1亚型(n=4);10份牛隐孢子虫阳性样本成功获得6条gp60基因亚型序列,鉴定出3种亚型,分别为ⅩⅩⅥb(n=2)、ⅩⅩⅥc(n=3)和ⅩⅩⅥe(n=1);4份芮氏隐孢子虫阳性样本均成功获得gp60基因亚型序列,均为ⅩⅩⅠb亚型。种系发育树分析结果显示,获得的微小隐孢子虫Ⅱd基因亚型序列与不同宿主源微小隐孢子虫Ⅱd亚型家族的序列同处于一个亚群,而与新西兰不同宿主源微小隐孢子虫Ⅱa家族亚型的序列形成不同亚群;获得的牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫的亚型序列均与我国不同地区牛源牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫的亚型序列同处一个大群。[结论]该引种场奶牛感染的隐孢子虫存在遗传多样分布特征,均为引进当地后感染,提示水源和草料污染可能是该场奶牛感染隐孢子虫的主要原因。

微小隐孢子虫含有纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白的亚细胞定位及其细胞黏附特性研究

目的本研究以微小隐孢子虫含有纤维连接蛋白Ⅲ型结构域蛋白(Cryptosporidium parvum fibronectin typeⅢdomain-containing protein,CpFN3)为研究对象,研究其亚细胞定位和黏附特性。方法该蛋白由cgd4_640基因编码、全长为含有2430个氨基酸的I型跨膜蛋白。设计特异性抗原多肽并免疫家兔,获得多克隆抗体,利用亲和纯化法获特异性抗体;经Western blot方法验证该抗体特异性,再通过间接免疫荧光法(IFA)进行蛋白定位。通过原核表达获得重组蛋白(His-CpFN3),通过ELISA确定重组蛋白与HCT-8细胞和肝素的结合情况。结果成功获得纯化的抗CpFN3抗体,Western blot分析显示该抗体可识别条带大小约为280 kDa;IFA结果表明该蛋白定位于子孢子的表膜,呈点状分布。该蛋白在子孢子入侵阶段及胞内无性繁殖和有性繁殖阶段均有表达。利用重组蛋白,确定了CpFN3能够与HCT-8细胞及肝素结合(结合常数Kd分别为0.23和1.21μmol/L),并呈剂量依赖性和可饱和性。结论本研究确定CpFN3参与了虫体与宿主细胞的黏附过程。

微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白CpAAT1的亚细胞定位研究

目的探究微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白的亚细胞定位。方法本研究以微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白1(Cryptosporidium parvum Amino acid transporter 1,CpAAT1)为研究对象,设计合成了特异性多肽片段,免疫家兔制备多克隆抗体。利用Western blot验证该抗体的特异性,通过间接免疫荧光的方法对该蛋白的亚细胞定位进行了分析。结果CpAAT1多克隆抗体能特异性识别虫体天然蛋白,后者在微小隐孢子虫生活史的各个时期均有表达。子孢子时期,CpAAT1定位于虫体表膜;无性生殖期时该蛋白定位在成熟的裂殖子表膜;在有性生殖阶段,雌雄配子体均可被该抗体标记。结论本研究为进一步探索微小隐孢子虫氨基酸转运蛋白的转运机制提供了一些新线索。