孤核受体NR4A1在H_(2)O_(2)诱导小鼠肾脏足细胞损伤中的作用

目的观察双氧水(H_(2)O_(2))诱导的小鼠肾脏足细胞(MPC-5)氧化应激中孤核受体(NR4A1)表达变化,以及其对细胞增殖和凋亡的影响。方法MPC-5分为空白对照组(H_(2)O_(2)处理浓度为0μmol/L或时间为0 h)和处理组(对应H_(2)O_(2)处理各浓度或时间),慢病毒感染后的MPC-5分为过表达组(Ad-NR4A1组)和空载对照组(Ad-Ctrl组)。采用H_(2)O_(2)处理MPC-5建立氧化应激模型;采用Q-PCR法检测H_(2)O_(2)处理MPC-5后,NR4A1 mRNA表达变化;采用Western blotting法检测NR4A1蛋白、凋亡相关蛋白Caspase 3(17 kDa)表达变化;采用慢病毒感染MPC-5,嘌呤霉素筛选并获得稳定过表达NR4A1的MPC-5细胞(Ad-NR4A1组)与空载细胞(Ad-Ctrl组),H_(2)O_(2)处理后,采用Western blotting法检测两组中Caspase 3表达;采用CCK8实验检测两组细胞增殖活性;采用TUNEL染色法检测两组细胞凋亡。结果H_(2)O_(2)处理后,与空白对照组相比,MPC-5中NR4A1 mRNA相对表达量和蛋白表达量均明显增加(P均<0.05),Caspase 3蛋白表达量高于空白对照组(P<0.05)。Ad-NR4A1组中NR4A1蛋白表达量高于Ad-Ctrl组(P<0.001)。H_(2)O_(2)处理后,Ad-NR4A1组中Caspase 3蛋白表达量高于Ad-Ctrl组(P<0.05),细胞凋亡比率高于Ad-Ctrl组(P<0.05),细胞增殖活性低于Ad-Ctrl组(P<0.05)。结论H_(2)O_(2)诱导氧化应激抑制MPC-5细胞增殖、促进细胞凋亡,其作用机制可能与诱导NR4A1表达并激活Caspase 3途径有关。

NR4A1通过IκBα/NF-κB通路调控过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的机制

目的探讨过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化应激中孤核受体NR4A1表达变化,以及其对细胞凋亡的影响及机制。方法使用不同浓度及时间梯度H_(2)O_(2)处理HUVECs,采用CCK-8法检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting法检测Bcl-2、Bax与NR4A1蛋白表达;采用siRNA转染建立敲低NR4A1与对照的HUVECs,分为si-NC组及si-NR4A1组,H_(2)O_(2)处理后检测各组细胞抑凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白Bax表达,TUNEL法检测细胞凋亡;采用慢病毒感染建立稳定过表达NR4A1与对照的HUVECs,并进行H_(2)O_(2)处理,分为空载对照组(NC组)、过表达组(OV组)、NC+H_(2)O_(2)组及OV+H_(2)O_(2)组。TUNEL法检测各组细胞凋亡、Western blotting法检测各组中NR4A1、Bcl-2、Bax、总IκBα的蛋白表达、P65蛋白在细胞核/质定位。结果200μmol/L H_(2)O_(2)处理细胞6 h,HUVECs活力显著下降,凋亡水平显著上升,Bax/Bcl-2比值升高(P<0.001);NR4A1蛋白表达量增加;与si-NC组相比,si-NR4A1组在H_(2)O_(2)处理后细胞凋亡率、Bax/Bcl-2比值下降(P<0.001);OV+H_(2)O_(2)组细胞凋亡率、Bax/Bcl-2比值较NC+H_(2)O_(2)组显著降低(P<0.001);相较于NC+H_(2)O_(2)组,P65蛋白在OV+H_(2)O_(2)组中细胞核内表达显著降低(P<0.05),细胞质内表达显著上调(P<0.001);与NC+H_(2)O_(2)组相比,OV+H_(2)O_(2)组总IκBα表达上调(P<0.001)。结论H_(2)O_(2)诱导HUVECs发生细胞凋亡;HUVECs内NR4A1蛋白过表达可抑制细胞凋亡,其作用机制可能与调控IκBα的表达与抑制NF-κB的核转位有关。

益气活血通络方调控NR4A1/TGF-β1负反馈环路抑制单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮间充质转化的机制

目的:观察益气活血通络方调控孤核受体4A(NR4A1)/转化生长因子-β1(TGF-β1)负反馈环路对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾小管上皮间充质转化(EMT)的影响。方法:将48只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、UUO组、氯沙坦组、益气活血通络方组,每组12只。除假手术组外,其余各组大鼠予以UUO造模。14 d后取材行HE和Masson染色观察肾脏组织病理形态;免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏附蛋白(E-cadherin)共定位,Western blot检测α-SMA、E-cadherin、NR4A1、TGF-β1的表达。体外采用TGF-β1刺激人肾小管上皮细胞(HK-2),予以过表达NR4A1及益气活血通络方含药血清干预,Western blot检测NR4A1、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1及vimentin表达变化。结果:与假手术组比较,UUO组肾小管扩张、萎缩、炎症细胞浸润及胶原沉积增多;TGF-β1、α-SMA、vimentin表达显著升高(P<0.05),NR4A1、E-cadherin表达显著降低(P<0.05);与UUO组比较,各治疗组肾小管损伤程度明显改善,胶原沉积减少;NR4A1、E-cadherin表达显著上调(P<0.05),TGF-β1、α-SMA、vimentin表达显著降低(P<0.05)。TGF-β1刺激HK-2后,NR4A1、E-cadherin表达显著降低(P<0.05),α-SMA、vimentin、TGF-β1表达显著升高(P<0.05),过表达NR4A1后,E-cadherin表达显著升高(P<0.05),α-SMA、vimentin、TGF-β1表达显著降低(P<0.05),中药可增加NR4A1表达来降低α-SMA、vimentin、TGF-β1表达,增加E-cadherin的表达(P<0.05)。结论:益气活血通络方可通过调控NR4A1/TGF-β1负反馈环路抑制UUO大鼠EMT改善肾纤维化。