内蒙古绒山羊孤核受体RORα部分cDNA克隆及序列分析

依据已发表的牛、狗、人、小鼠等哺乳动物孤核受体RORα基因序列设计跨内含子引物,以内蒙古绒山羊cD-NA为模板进行RT-PCR扩增,得到417bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GeneBank数据库进行序列同源性比较分析:绒山羊RORαcDNA扩增序列与牛、狗、猪和小鼠的同源性分别为98.3%、95.4%、95.2%和87.8%;与牛、猪、人、马、鼠相比RORα基因氨基酸序列同源性非常高,说明所获得序列为内蒙古绒山羊RORαcDNA序列,而且各种哺乳动物的RORα基因保守性较强。

支气管肺发育不良小鼠肺组织FOXP3^(+)调节性T细胞(Treg)数量减少且向RORγt^(+)FOXP3^(+)Treg转换

目的 探讨调节性T淋巴细胞(Treg)表型转换在支气管肺发育不良(BPD)小鼠肺组织中的作用。方法 C57BL/6新生小鼠随机分成空气组及高氧组,每组10只,高氧组建立新生小鼠高氧暴露的BPD动物模型。在小鼠生后7 d和14 d,每组各处死5只小鼠,取出新鲜肺组织。HE染色观察肺组织病理变化,Western blot法检测肺表面活性蛋白C(SP-C)表达水平;流式细胞术检测肺组织中叉头盒P3(FOXP3)^(+)Treg及维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)^(+)FOXP3^(+)Treg占CD4^(+)淋巴细胞百分比,ELISA检测肺组织中白细胞介素17A(IL-17A)、 IL-6的含量。采用Spearman相关分析法分析FOXP3^(+)Treg与SP-C相对表达量的相关性以及RORγt^(+)FOXP3^(+)Treg与IL-17A、 IL-6含量的相关性。结果 与同时间点空气组相比,高氧组肺泡结构简单化,放射状肺泡计数与SP-C相对表达水平均明显下降,高氧组FOXP3^(+)Treg占比减少,RORγt^(+)FOXP3^(+)Treg占比增多,肺组织IL-17A、 IL-6含量明显升高。FOXP3^(+)Treg与SP-C相对表达水平呈正相关,RORγt^(+)FOXP3^(+)Treg与IL-17A、 IL-6含量呈正相关。结论 BPD小鼠肺组织FOXP3^(+)Treg数量减少并向RORγt^(+)FOXP3^(+)Treg转换,可能参与高氧所致肺损伤。

鸡RORα真核表达载体的构建及其在MSB1细胞中的表达

为构建鸡维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptorα,RORα)的真核表达载体,并检测其在MSB1细胞中的表达效果,本研究参照GenBank中鸡RORα基因序列(登录号:NM_001289887.1)设计特异性引物,从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,将扩增的特异性RORα基因片段连接pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-RORα,再用SalⅠ和BamHⅠ双酶切克隆载体pMD18-T-RORα和真核表达载体pEGFP-N1,将酶切回收的RORα与pEGFP-N1片段进行连接,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-RORα,经PCR、酶切和测序验证准确性后,将其转染MSB1细胞,于转染后48h荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并采用实时荧光定量PCR检测鸡RORα在MSB1细胞中的表达水平。结果显示,从构建的重组质粒pEGFP-N1-RORα中可扩增出大小约1 600bp的特异性片段,用SalⅠ和BamHⅠ可切出大小约4 700和1 600bp的两条带。实时荧光定量PCR结果显示,转染MSB1细胞48h后,与对照组相比,重组真核表达载体转染组中鸡RORα基因mRNA水平显著增加(P<0.05)。表明本试验成功构建了鸡RORα的真核表达载体,该载体可在MSB1细胞中表达鸡RORα,为进一步研究鸡RORα对MSB1细胞增殖的影响奠定基础。

沉默RORα通过活化Wnt/β-catenin通路靶基因促进人胃癌细胞增殖

目的探讨人胃癌细胞中维甲酸相关孤核受体(ROR)α与Wnt/β-连环素(catenin)通路的相互作用。方法噻唑蓝(MTT)实验验证沉默RORα对胃癌细胞系MGC803的增殖作用;实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹与免疫共沉淀检测敲低RORα对Wnt/β-catenin通路相关分子与靶基因表达;荧光素酶报告检测c-Myc基因启动子活性。结果敲低RORα可显著促进胃癌细胞增殖(P<0.05)。当RORα被敲低时可显著上调Wnt1 mRNA和蛋白表达(P<0.05);但对β-catenin无明显影响(P>0.05)。免疫共沉淀提示敲低RORα可显著降低RORα与β-catenin的结合效率(P<0.05)。RORα敲低后,核内β-catenin与转录因子(TCF)-4表达水平明显升高(P<0.05)。Wnt通路下游基因Axin、c-Myc、c-Jun和基质金属蛋白酶(MMP)-9的mRNA和蛋白水平显著上调(P<0.05)。荧光素酶报告提示,敲低RORα可显著增强c-Myc启动子活性(P<0.05)。结论敲低RORα可活化Wnt/β-catenin信号通路从而促进胃癌细胞增殖。

Wnt5a和ROR1在骨肉瘤中的表达及临床意义

目的探讨Wnt5a和受体酪氨酸激酶样孤核受体1(ROR1)在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学SP法检测35例骨肉瘤和15例骨软骨瘤中Wnt5a及ROR1的表达情况,并分析两者表达与临床病理特征及预后的关系。结果 Wnt5a和ROR1在骨肉瘤组织中的阳性表达率分别为62.9%(22/35)和57.1%(20/35),明显高于骨软骨瘤组织的13.3%(2/15)和6.7%(1/15),差异均有统计学意义(P<0.05)。在骨肉瘤组织中,Wnt5a和ROR1的表达与Enneking分期和远处转移密切相关(P<0.05)。Wnt5a与ROR1的表达呈正相关(r=0.888,P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析显示,Wnt5a和ROR1阳性表达者的中位生存时间分别为23个月和27个月,明显短于阴性表达者的41个月和42个月(P<0.05)。结论 Wnt5a和ROR1在骨肉瘤中呈高表达,其阳性表达可能与骨肉瘤的发生、发展密切相关,联合检测Wnt5a、ROR1对于判断骨肉瘤的进展及预后具有重要意义。

Th17细胞及其相关细胞因子在胃癌中的表达及临床意义

[目的]检测Th17细胞及其相关细胞因子在胃癌中的表达,探讨其与胃癌临床病理因素之间的关系。[方法]收集45例胃癌患者和20例健康体检者外周血,分离单个核细胞(PBMC),采用流式细胞分析技术检测Th17细胞比例;收集30例手术切除胃癌组织标本,包括癌组织和非癌对照组织,采用免疫组化法检测胃癌组织内Th17细胞浸润情况;采用荧光定量RT-PCR法检测Th17细胞相关因子维甲酸相关孤核受体C(RORc)、IL-17、IL-23、IL-21、IL-22、IL-1β、TGF-β、IL-6 m RNA表达。[结果 ]与健康对照组相比,胃癌患者外周血中Th17细胞比例显著增多;胃癌组织内可见大量CD4+/IL-17+细胞浸润,而非癌对照组织内极少见CD4+/IL-17+细胞;与非癌对照组织相比,胃癌组织内RORc、IL-17、IL-21、TGF-β、IL-6 m RNA表达水平明显增高,但两组间IL-22、IL-23和IL-1βm RNA表达无显著差异。胃癌组织内RORc m RNA表达水平与IL-17、TGF-β、IL-6 m RNA表达水平呈正相关;并且,RORc m RNA表达水平与患者TNM分期有相关性。[结论]Th17细胞促进了胃癌的发生和进展。

成人特发性膜性肾病患者外周血中调节性T细胞和辅助性T细胞17的比例变化研究

目的研究特发性膜性肾病(IMN)患者外周血和肾组织中调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)的比例变化,探讨Treg和Th17比例失衡参与IMN发病的可能机制。方法选取于上海交通大学医学院附属新华医院就诊经肾活检确诊为IMN的患者(IMN组,n=30)、健康志愿者(健康对照组,n=20)及行肾癌手术者(肾癌对照组,n=10)为研究对象。采用流式细胞仪测定IMN组和健康对照组外周血单核细胞(PBMC)中Treg和Th17的表达;实时聚合酶链反应(PCR)法检测PBMC中叉状头/翅膀状螺旋转录因子3(Foxp3)和维甲酸相关孤核受体(RORγt)的表达水平;采用免疫组化法检测IMN组和肾癌对照组肾组织中IL-17的表达。结果流式细胞仪检测结果显示,与健康对照组相比,IMN组PBMC中CD4^+Foxp3^+Treg表达水平降低(P<0.05),Th17表达水平升高(P<0.05),Treg/Th17比值显著降低(P<0.01)。PCR检测结果显示,与健康对照组相比,IMN组PBMC中Foxp3 mRNA的表达水平明显下调(P<0.01),RORγt mRNA水平明显上调(P<0.01)。免疫组化结果显示,IMN组患者肾组织中IL-17的表达较肾癌对照组患者显著升高(P<0.05),主要体现于肾小管处。相关性分析显示,IMN组患者外周血Treg/Th17比值与24 h尿蛋白定量水平呈明显负相关(r=-0.537,P<0.05),与血清白蛋白水平呈明显正相关(r=0.669,P<0.05)。结论 IMN患者外周血中存在Treg表达水平降低和Th17表达水平升高的比例失衡,而Treg/Th17比例失衡与IMN的发病机制有关。

胎元饮合寿胎丸加减联合主动免疫治疗不明原因复发性流产患者的疗效及其对辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞免疫失衡的影响

目的：探讨胎元饮合寿胎丸加减治疗不明原因复发性流产患者的临床效果及其机制。方法：选择2015年1月至2016年3月收治的96例不明原因复发性流产（URSA）患者,根据随机数表法分为对照组和观察组,每组48例。对照组给予主动免疫治疗,观察组采用胎元饮合寿胎丸加减联合主动免疫治疗。比较两组的妊娠成功率及妊娠结局。测定并比较两组外周血Th17细胞,Treg细胞,炎症因子白细胞介素（IL）-4,IL-10,IL-17,Th17,Treg转录因子维甲酸相关孤核受体γt（RORγt）,Fox P3 mRNA表达水平。比较两组治疗中不良反应发生情况。结果：对照组再次妊娠率95.8%,与观察组的97.9%比较差异无统计学意义。观察组的妊娠成功率93.8%（45/48）,明显高于对照组的77.1%（37/48）（P〈0.05）。观察组的足月分娩比例为95.6%,明显高于对照组的81.1%（P〈0.05）。治疗后两组的Th17/CD4＋,Th17/Treg较本组治疗前明显降低,Treg/CD4＋较本组治疗前明显升高（P〈0.05）,且观察组的变化程度较对照组更加明显（P〈0.05）。治疗后两组的IL-4,IL-10水平均较本组治疗前上升,IL-17水平降低（P〈0.05）;治疗后观察组IL-4,IL-10水平较对照组高,IL-17水平较对照组低（P〈0.05）。治疗后两组RORγt mRNA表达水平较本组治疗前降低,Fox P3 mRNA表达水平较本组治疗前升高（P〈0.05）;观察组Fox P3,RORγt mRNA变化水平较对照组更加明显（P〈0.05）。所有患者均无明显不良反应发生。结论：采用胎元饮合寿胎丸加减联合主动免疫治疗不明原因复发性流产疗效确切,其机制可能通过调节炎性因子水平,改善Th17/Treg的免疫失衡状态,进而改善妊娠结局,降低流产率,且安全性较高,治疗成本低,值得临床推广应用。