基于遗传算法的安丝菌素P-3分批发酵动力学研究

安丝菌素是微生物来源的美登类生物碱,具有显著抗肿瘤活性。研究安丝菌素P-3(AP-3)产生菌珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565分批发酵动力学。首先探讨了5L自控发酵罐中ATCC31565分批发酵过程中菌体生长、AP-3合成和基质消耗的变化规律。基于遗传算法对实验数据进行处理得到了ATCC31565分批发酵合成AP-3的动力学模型参数及遗传算法进化结果图。结果表明,基于遗传算法对动力学模型拟合较好,可以较好地描述ATCC31565生产AP-3的发酵动力学规律。

安丝菌素P-3生产菌株Actinosynnema pretiosum ssp. auranticum的诱变育种及其发酵培养基优化

为了提高安丝菌素P-3(AP-3)的发酵产量,通过紫外诱变并运用紫外-分光光度法建立96孔板高通量快速筛选体系对原始菌株(Actinosynnema pretiosum ssp. auranticum)进行育种,筛选获得了一株产量较高的突变菌株B24-13。发酵7天后,其发酵液中AP-3的含量为112.5mg/L,是原始菌株的2.03倍。随后通过单因素优化与正交实验设计对突变菌株B24-13进行发酵培养基优化,得到最优发酵培养基组分:蔗糖25g/L,甘油15g/L,玉米浆25g/L,CaCO3 7g/L,异丁醇2g/L,缬氨酸0.5g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5g/L,FeSO_4·7H_2O 0.01g/L。对优化结果进行验证实验,发酵7天后AP-3的产量为(127.5±6.3)mg/L。实验结果表明:通过对生产菌株的诱变育种与发酵培养基优化可有效的提高AP-3的发酵产量,也从侧面验证了该研究所建立的96孔板高通量快速筛选体系用于AP-3高产菌株的初筛是可行的。

奇迹束丝放线菌合成安丝菌素过程中支链氨基酸的添加效果分析

安丝菌素是一类重要的聚酮抗生素,由AP-1,AP-2,AP-3,AP-3′和AP-4 5个组分组成,其中AP-3的活性最强,通常作为发酵的目标产物。奇迹束丝放线菌合成安丝菌素的摇瓶实验发现,添加支链氨基酸(BCAAs)可明显影响安丝菌素的产量以及组分。为了进一步验证支链氨基酸对安丝菌素生物合成的作用,选用合成培养基并在不同时段添加支链氨基酸进行发酵实验,实验结果显示,发酵48h后加入0.5g/L缬氨酸(Val)能使AP-3增产1倍左右;而在同一时刻添加等量的亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)对AP-3的抑制作用较明显,产量分别下降了58.8%和83.3%,且添加Leu和Ile分别使得AP-4与AP-2组分增加。此外,添加Ile可使琥珀酸与乙酸的积累量都明显上升,而添加Val使得细胞分泌琥珀酸和乙酸明显变少,这意味着奇迹束丝放线菌代谢支链氨基酸不仅影响对聚酮途径以及侧链合成,对细胞的代谢状态也有一定影响。

珍贵橙色束丝放线菌固体发酵合成安丝菌素P-3的工艺探索

为了探索珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)合成安丝菌素P-3(AP-3)的固体发酵培养条件的最佳工艺,利用农副产品(玉米淀粉、玉米粉、棉籽饼粉、豆粕、豆饼粉、菜籽饼粉、麦麸、米糠)作为固料,采用单因素实验和正交实验对固体发酵培养基组成及培养条件进行摸索。得到合成AP-3固体发酵的最佳培养基组分为:玉米淀粉、豆粕及棉籽饼粉的质量配比为1∶1∶1,红糖4%,玉米浆干粉2%,CaCl2 1%。最佳固体发酵工艺条件为:初始pH为7.5,培养温度28℃,固液比(质量比)为1∶0.8,装量25g(250mL锥形瓶),接种量150mL/kg,培养时间为7天,最优条件下AP-3的产量为(26.86±1.87)mg/kg(每千克培养基)。本研究为发酵合成安丝菌素提供了新的方法与思路。

珍贵束丝放线菌固体发酵生产安丝菌素及安丝菌素P-0制备

目的获得安丝菌素及安丝菌素P-0纯品。方法珍贵束丝放线菌ATCC 31565经固体发酵培养,培养物乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析后得到安丝菌素P-2、P-3和P-4混合物。安丝菌素混合物经化学法脱去C-3酰基侧链,采用制备型HPLC获得安丝菌素P-0纯品。结果每升固体发酵培养基可获得安丝菌素P-2、P-3和P-4混合物(98±2)mg(纯度85%)。50mg该安丝菌素样品可获得安丝菌素P-0纯品约31mg(纯度大于99%),产率约82%。结论将安丝菌素固体发酵培养与提取、去酰基化和HPLC纯化相结合,建立了一套安丝菌素P-0纯品的实验室制备工艺。

珍贵橙色束丝放线菌发酵产安丝菌素P-3的分离纯化工艺优化

安丝菌素是从珍贵橙色束丝放线菌的发酵液中分离出来的苯安莎类抗生素,具有显著的抗肿瘤活性。常采用乙酸乙酯对发酵液进行分离萃取,然而其发酵液成分复杂,除菌丝体外还含有许多杂蛋白质及易溶于有机溶剂的色素,这对后续提取和精制有很大的影响,影响产品质量和回收率。本文通过对AP-3发酵液进行预处理,将AP-3发酵液调整pH至3后,用10g/L硅藻土辅助抽滤;收集滤液,添加20g/L活性炭于60℃吸附2h,然后用洗脱液乙酸乙酯对活性炭进行脱附处理,2h后达到动态洗脱平衡,对洗脱液采用中性氧化铝柱层析,以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂进行梯度洗脱,最终获得AP-3纯度86.15%,经重结晶后得到AP-3纯品,经过HPLC检测AP-3纯度达95%。

安丝菌素P-3的摇瓶发酵培养基优化

为了优化安丝菌素P-3(AP-3)的摇瓶发酵培养基,以AP-3产量为主要指标,在单因素试验的基础上,利用均匀试验设计U*15(157)对培养基中碳源、氮源和前体异丁醇进行优化。得到最适培养基配方为葡萄糖4.22%,麦芽糖0.75%,玉米浆3.42%,乙酸铵0.41%,异丁醇0.43%,碳酸钙0.50%,氢氧化钠0.12%,磷酸氢二钾0.10%,p H(7.4±0.2)。在此条件下进行验证试验,AP-3产量为(51.86±1.33)mg/L,与模型预测值接近。表明该优化方法切实可行,能够获得较高的AP-3产量。

双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870对安丝菌素生物合成的调控机制研究

目的探究珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870对A.pretiosum中安丝菌素P-3(AP-3)生物合成的调控机制。方法本研究以A.pretiosum X47菌株为出发菌株,构建双组分转导系统CNX_RS34865/CNX_RS34870中调控基因CNX_RS34870的缺失突变菌株;利用HPLC分析及生物活性测定分析出发菌株X47与CNX_RS34870突变菌株(ΔRS34870)的AP-3产量差异;利用转录组测序分析菌株之间各基因的转录水平差异,分析CNX_RS34870对菌株AP-3生物合成的影响及作用机制。结果与出发菌株X47相比,ΔRS34870菌株在液体发酵条件下AP-3生物合成量显著下降,在第6天时,ΔRS34870菌株AP-3产量降低了36.94%。转录水平分析显示ΔRS34870菌株中1524个基因的转录较X47明显不同,其中AP-3生物合成基因簇中的asm1、asm2、asm30、asm32、asm33、asm34、asm35和asm37基因以及与初级代谢中与AP-3前体合成相关的pgk基因出现了显著下调。结论CNX_RS34870是菌株AP-3生物合成的正调控基因,可通过调控AP-3生物合成基因簇的转录以及影响初级代谢从而影响AP-3的产生。本研究将为了解AP-3生物合成的调控网络以及工业菌株的遗传改造提供理论指导。

生物合成安丝菌素的研究进展

安丝菌素(Ansamitocin)是一种微生物来源的美登素类抗生素,具有独特的抗癌活性,其中AP-3在安丝菌素中所占比例最高,是发酵的目标产物,在临床上有靶向治疗乳腺癌的效果,因此具有重要的药用研究价值。但当前AP-3的微生物发酵产量不高,高昂的生产成本制约了其进一步的应用。本文在阐述安丝菌素生物合成及代谢调控机制的基础上,分析讨论了微生物发酵产安丝菌素过程中菌种选育、发酵复杂过程的控制与优化以及下游的分离纯化技术等研究进展。再对未来利用新型诱变技术、合成生物学技术与辅因子工程改造等方法选育高产安丝菌素的工程菌株,以及开发高效创新、低成本的分离纯化工艺进行了展望,以期显著地提高安丝菌素的发酵水平,为工业化安丝菌素的发展奠定坚实的基础。

asm基因表达量与安丝菌素P-3产量相关性分析

目的:探讨6种asm基因表达水平与安丝菌素P-3(AP-3)产量的相关性。方法:发酵培养珍贵束丝放线菌ATCC31565,高效液相色谱法检测发酵液中AP-3的产量,实时荧光定量PCR检测asm基因表达量并与AP-3产量进行相关性比对。结果:asm2和asm36基因表达量随培养时间增加而升高,与AP-3产量呈显著的正相关性(P<0.001);asm20和asm39基因表达量在生产后期显著升高,与AP-3产量具有正相关性(P<0.05);asm28和asm30基因表达量与AP-3产量没有显著相关性。结论:asm2和asm36基因表达量与AP-3产量之间存在正相关性,提示该基因对AP-3合成的正向调控功能,为今后提高AP-3产量的合成途径改造提供了候选基因,为后续AP-3产量的提高奠定了基础。

高产安丝菌素的珍贵束丝放线菌菌种选育

以珍贵束丝放线菌FRCS-025为出发菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对其孢子进行处理,筛选得到了一株安丝菌素AP-3高产菌株ARTP-054,其产量可达235.16mg/L,较原始菌株FRCS-025的产量164.12 mg/L,提高了43.3%。以筛选出的ARTP-054高产菌为出发菌株,进行化学诱变,选取浓度为0.4 g/L的亚硝基胍对其孢子悬液进行处理,且使用安丝菌素AP-3支链前体异丁醇进行底物限制性筛选,结合发酵复筛,最终筛得一株安丝菌素AP-3高产菌株HF-064,产量达287.64 mg/L,较原始菌株产量提高了75.3%。经50 L发酵罐验证试验,发现诱变后菌株遗传稳定性良好,168 h产量高达292.36 mg/L。

试论阿维菌素和安丝菌素生物合成相关基因的功能

阿维菌素属于十六元大环内酯类抗生素,是由阿维链霉菌产生的,具有高效、广谱的抗人类寄生虫以及各种线虫和昆虫的活性,被广泛应用于畜牧业、农业的病虫害防治。安丝菌素属于安莎类抗生素,是从珍贵束丝放线菌橙色变种ATCC 31565中分离出的,具有一定的催化活性及抗肿瘤、抗结核杆菌、抗细菌等多种药理活性。本文就阿维菌素和安丝菌素生物合成相关基因的功能进行综述。

一种检测安丝菌素效价的生物检定方法——木霉平板法

本文报道一种安全高效的安丝菌素生物检定方法。对1株安丝菌素敏感的真菌进行了ITS序列系统进化树分析,确定其属于木霉属,并将其命名为木霉CPCC 400749。采用PDA培养基制备了木霉CPCC 400749检定平板并用于测定安丝菌素效价,测定结果与HPLC分析方法得到的数值基本一致。本文报道的安丝菌素生物检定方法具有安全高效特点,有望用于高通量筛选束丝放线菌安丝菌素高产菌株。

安丝菌素聚酮合酶模块2中脱水酶结构域的生化功能

【目的】I型聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)模块中不同的修饰是聚酮类化合物结构多样性的重要原因之一。抗癌药物安丝菌素化学结构中C11-C14区域存在特殊的双键迁移结构,可能与聚酮合酶模块2或者3中脱水酶结构域(Dehydratase,DH)的催化密切相关,本研究通过探究聚酮合酶模块2中DH结构域(Ansa DH_2)的生化功能,确定其在安丝菌素聚酮链延伸过程中的脱水功能。【方法】本文以安丝菌素产生菌Actinosynnema pretiosum subsp. pretiosum ATCC 31280为研究材料,首先,对安丝菌素聚酮合酶模块中的4个不同DH结构域进行了生物信息学分析;然后,利用化学方法合成了Ansa DH_2的底物类似物waq-1,建立和优化了Ansa DH_2的体外生化反应体系;并利用ESI-MS~2的方法鉴定了Ansa DH_2催化形成的终产物的结构,确定了Ansa DH_2在安丝菌素聚酮链延伸中的α-β脱水作用;最后,通过定点突变的策略,对Ansa DH_2的关键氨基酸进行了鉴定。【结果】通过生物信息学分析显示Ansa DH_2和Ansa DH_3与已报道的催化双键迁移的DH结构域进化关系近;通过六步线性化学反应合成了Ansa DH_2底物类似物waq-1,终产率为17.81%;建立并优化了Ansa DH_2的生化反应条件,使36 h的底物转化率达到45%;通过对Ansa DH_2催化形成的终产物的结构鉴定,证明安丝菌素聚酮链延伸过程中Ansa DH_2催化底物类似物发生了α-β脱水;最后,氨基酸的定点突变证明了Ansa DH_2第48位的组氨酸(H)是脱水活性的必需氨基酸。【结论】本研究证明了Ansa DH_2具有催化α-β脱水的功能,丰富了DH结构域的研究,为后续研究安丝菌素聚酮链延伸过程中的双键迁移奠定了基础。

安丝菌素产生菌拟诺卡氏菌EGI80425接合转移体系的建立与应用

安丝菌素是一种有强抗肿瘤作用的天然产物,拟诺卡氏菌Nocardiopsis ansamitocini EGI80425作为安丝菌素的产生菌具有重要的研究价值,因此需要建立其遗传操作体系,并实施对该菌株的遗传改造。首先,通过优化菌丝体接合转移相关的培养时间、供受体比例和培养基中Mg2+浓度等,建立了效率为6.6×10^-3的整合型载体p IB139的接合转移方法;然后在此基础上进一步调整相关条件,建立了效率为6.2×10^-4的游离型质粒p JTU1278的接合转移方法;最后,利用游离型质粒对潜在的PKS竞争基因簇ClusterⅠ和ClusterⅦ进行了缺失。结果显示,ClusterⅠ缺失突变株CXY01中安丝菌素的产量为12.6 mg/L,相比野生型提高了95.3%;ClusterⅦ缺失突变株CXY02中安丝菌素产量为7.4 mg/L,相比野生型提高了15.2%。本研究建立了N. ansamitocini EGI80425的遗传操作体系,并在此基础上对该菌进行了基因组片段敲除,有效提升了安丝菌素产量,为利用N. ansamitocini大量产生安丝菌素奠定了基础。

基于ARTP诱变的安丝菌素P-3高产菌株高通量筛选

美登素家族的安丝菌素P-3(ansamitocin,AP-3)属于大环内酰胺类抗生素,有极强的抗肿瘤活性。鉴于其重要的药用价值和广阔的市场前景,提高AP-3的产量成为国内外研究重点。本研究采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术,并结合24深孔板发酵及以线黑粉酵母(Filobasidium uniguttulatum)为指示菌的高通量生物测定筛选技术,最终筛选到两株AP-3产量稳定提高15%的珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的突变株——M13和M144。并对高通量生测筛选技术进行了优化,最终确定实验过程的最佳参数:在液体摇瓶YPD中培养15 h时线黑粉酵母指示菌株可达到对数生长中期,且当摇瓶转接至孔板的接种量为10%时,指示菌与AP-3混合培养至30 h达到稳定期,可以明显观察到指示菌在0.2~0.7μg/mL AP-3浓度范围内的线性生长变化,酶标仪OD_(600)读数与AP-3浓度之间的标准曲线为y=0.0228x+1.8377,R^(2)=0.9906。以AP-3产量提高15%作为筛选指标,可筛选出高产突变株。对经高通量生测筛选出的突变株经10轮传代发酵后,最终筛选出两株AP-3产量稳定提高的突变株M13和M144。经二代重测序后,可定位突变株内部的突变位点,为今后从全基因组层面解析AP-3的高产原因,以及建立珍贵束丝放线菌ATCC31280的代谢网络提供理论基础。

基因组重排提高珍贵橙色束丝放线菌中安丝菌素P-3

安丝菌素P-3(ansamitocin P-3,AP-3)是一种具有高抗肿瘤活性的安莎类抗生素,为了进一步提高AP-3高产菌的产量,开展了利用基因组重排技术提高AP-3发酵水平的研究。首先对AP-3生产菌珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)原生质体制备、处理、融合条件进行了初步优化,然后以常温常压等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变技术得到的高产菌株L-40、L-117、L-506、L-522作为出发亲本进行三轮基因组重排,通过高通量筛选最终筛选出一株高产融合子G3-96,其AP-3产量约为335.9 mg/L,该菌株AP-3产量比亲本提高了47.5%,比野生型菌株提高了93.8%。实验结果表明基因组重排对于产物产量的提升是个非常不错的策略,为发酵生产合成提供了良好的菌株基础。

适应性进化与甜菜碱的添加促进安丝菌素的生产

【背景】安丝菌素是一类由珍贵束丝放线菌橙色亚种(Actinosynnema pretiosum ssp.auranticu)生产的美登素类衍生抗生素,属于大环内酰胺类物质,根据不同的C-3位基团可以分为一系列衍生物。目前已上市的高效抗癌药物曲妥珠单抗(T-DM1)以AP-3 (Ansamitocin P-3)为生产底物,并表现出很好的乳腺癌治疗效果。然而当前AP-3的产量较低,其过高的成本限制了进一步发展。【目的】应用适应性进化及添加适量甜菜碱策略提高安丝菌素AP-3的产量。【方法】以珍贵束丝放线菌橙色亚种为出发菌株,链霉素和巴龙霉素为胁迫压力进行适应性进化,筛选出安丝菌素积累较高的菌株,随后向进化菌株的发酵培养基中添加0.1%的甜菜碱,AP-3的产量进一步提高,同时分析了进化菌株AP-3相关基因的转录水平,初步探索进化菌株安丝菌素积累提高的原因。【结果】得到2株进化菌株Str16-4-4和Par16-2-1,发酵7d后AP-3产量分别提高了33.4%和31.7%,添加甜菜碱后其AP-3产量相比出发菌株提高了54.6%和47.4%。【结论】通过适应性进化的策略获得了AP-3生产能力提高的珍贵束丝放线菌橙色亚种进化菌株,对促进AP-3的生产提供了新思路,而且为适应性进化策略提高目标产物的产量提供了新的例证。

安丝菌素P-3的发酵工艺

考察了珍贵橙色束丝放线菌SIPI-3-21生产安丝菌素P-3(AP-3)的发酵工艺。首先优化了摇瓶发酵培养基配方,在含葡萄糖20.0 g/L、玉米淀粉30.0 g/L、棉籽饼粉30.0 g/L、CaCl2 10.0 g/L和CaCO3 5.0 g/L的发酵培养基中发酵培养9 d,AP-3产量为123.2 mg/L。进一步在摇瓶中考察了前体异丁醇对AP-3合成的影响,结果表明,添加异丁醇可以显著提高AP-3的产量。当其添加浓度为54 mmol/L时,AP-3的产量为307.8 mg/L,同时发酵液中AP-3的含量从57.2%提高到86.5%。

基于丙酰辅酶A通量优化的安丝菌素P-2(AP-2)高产

微生物来源的安丝菌素是植物来源的美登素的结构类似物,在传统工业生产中常用来替代美登素作为抗体药物偶联物(ADC)的毒素分子部分,因此获得安丝菌素高产菌株及高产培养基尤为重要。本研究首先在初始培养基中依次添加异亮氨酸、正丙醇和丙酸钠等三碳单元前体,对发酵培养基进行优化。发酵结果表明,添加10 mmol/L异亮氨酸的培养基(FI)可使AP-2产量提高1.23倍,达到(22.12±1.5)mg/L;在FI培养基中添加1.5%正丙醇(FIP),可使AP-2产量再增加74.5%,达到(36.85±3.62)mg/L;在FIP培养基中添加25 mmol/L丙酸钠(FIPP),可使AP-2产量再增加近31%,达到(48.31±0.67)mg/L。在高产培养基基础上,为了进一步提高AP-2产量,使用同源重组双交换方法缺失NXJ24菌株中的丙酰辅酶A羧化酶基因APASM6339;发酵结果表明,使用FIP培养基进行发酵,丙酰辅酶A羧化酶基因APASM6339缺失突变株的AP-2产量比出发菌株NXJ24提高了9.4倍,达到(98.93±0.19)mg/L,获得AP-2高产菌株ZY-1。该研究表明,提高珍贵束丝放线菌中胞内丙酰辅酶A的代谢通量是提高AP-2产量的重要策略,且通过改变安丝菌素C3位不同酰基侧链在珍贵束丝放线菌胞内的比例,可定向改变安丝菌素不同组分的生产比例。