安丝菌素P-3生产菌株Actinosynnema pretiosum ssp. auranticum的诱变育种及其发酵培养基优化

为了提高安丝菌素P-3(AP-3)的发酵产量,通过紫外诱变并运用紫外-分光光度法建立96孔板高通量快速筛选体系对原始菌株(Actinosynnema pretiosum ssp. auranticum)进行育种,筛选获得了一株产量较高的突变菌株B24-13。发酵7天后,其发酵液中AP-3的含量为112.5mg/L,是原始菌株的2.03倍。随后通过单因素优化与正交实验设计对突变菌株B24-13进行发酵培养基优化,得到最优发酵培养基组分:蔗糖25g/L,甘油15g/L,玉米浆25g/L,CaCO3 7g/L,异丁醇2g/L,缬氨酸0.5g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5g/L,FeSO_4·7H_2O 0.01g/L。对优化结果进行验证实验,发酵7天后AP-3的产量为(127.5±6.3)mg/L。实验结果表明:通过对生产菌株的诱变育种与发酵培养基优化可有效的提高AP-3的发酵产量,也从侧面验证了该研究所建立的96孔板高通量快速筛选体系用于AP-3高产菌株的初筛是可行的。

珍贵橙色束丝放线菌固体发酵合成安丝菌素P-3的工艺探索

为了探索珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)合成安丝菌素P-3(AP-3)的固体发酵培养条件的最佳工艺,利用农副产品(玉米淀粉、玉米粉、棉籽饼粉、豆粕、豆饼粉、菜籽饼粉、麦麸、米糠)作为固料,采用单因素实验和正交实验对固体发酵培养基组成及培养条件进行摸索。得到合成AP-3固体发酵的最佳培养基组分为:玉米淀粉、豆粕及棉籽饼粉的质量配比为1∶1∶1,红糖4%,玉米浆干粉2%,CaCl2 1%。最佳固体发酵工艺条件为:初始pH为7.5,培养温度28℃,固液比(质量比)为1∶0.8,装量25g(250mL锥形瓶),接种量150mL/kg,培养时间为7天,最优条件下AP-3的产量为(26.86±1.87)mg/kg(每千克培养基)。本研究为发酵合成安丝菌素提供了新的方法与思路。

珍贵橙色束丝放线菌发酵产安丝菌素P-3的分离纯化工艺优化

安丝菌素是从珍贵橙色束丝放线菌的发酵液中分离出来的苯安莎类抗生素,具有显著的抗肿瘤活性。常采用乙酸乙酯对发酵液进行分离萃取,然而其发酵液成分复杂,除菌丝体外还含有许多杂蛋白质及易溶于有机溶剂的色素,这对后续提取和精制有很大的影响,影响产品质量和回收率。本文通过对AP-3发酵液进行预处理,将AP-3发酵液调整pH至3后,用10g/L硅藻土辅助抽滤;收集滤液,添加20g/L活性炭于60℃吸附2h,然后用洗脱液乙酸乙酯对活性炭进行脱附处理,2h后达到动态洗脱平衡,对洗脱液采用中性氧化铝柱层析,以乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂进行梯度洗脱,最终获得AP-3纯度86.15%,经重结晶后得到AP-3纯品,经过HPLC检测AP-3纯度达95%。

安丝菌素P-3的摇瓶发酵培养基优化

为了优化安丝菌素P-3(AP-3)的摇瓶发酵培养基,以AP-3产量为主要指标,在单因素试验的基础上,利用均匀试验设计U*15(157)对培养基中碳源、氮源和前体异丁醇进行优化。得到最适培养基配方为葡萄糖4.22%,麦芽糖0.75%,玉米浆3.42%,乙酸铵0.41%,异丁醇0.43%,碳酸钙0.50%,氢氧化钠0.12%,磷酸氢二钾0.10%,p H(7.4±0.2)。在此条件下进行验证试验,AP-3产量为(51.86±1.33)mg/L,与模型预测值接近。表明该优化方法切实可行,能够获得较高的AP-3产量。

asm基因表达量与安丝菌素P-3产量相关性分析

目的:探讨6种asm基因表达水平与安丝菌素P-3(AP-3)产量的相关性。方法:发酵培养珍贵束丝放线菌ATCC31565,高效液相色谱法检测发酵液中AP-3的产量,实时荧光定量PCR检测asm基因表达量并与AP-3产量进行相关性比对。结果:asm2和asm36基因表达量随培养时间增加而升高,与AP-3产量呈显著的正相关性(P<0.001);asm20和asm39基因表达量在生产后期显著升高,与AP-3产量具有正相关性(P<0.05);asm28和asm30基因表达量与AP-3产量没有显著相关性。结论:asm2和asm36基因表达量与AP-3产量之间存在正相关性,提示该基因对AP-3合成的正向调控功能,为今后提高AP-3产量的合成途径改造提供了候选基因,为后续AP-3产量的提高奠定了基础。

基于ARTP诱变的安丝菌素P-3高产菌株高通量筛选

美登素家族的安丝菌素P-3(ansamitocin,AP-3)属于大环内酰胺类抗生素,有极强的抗肿瘤活性。鉴于其重要的药用价值和广阔的市场前景,提高AP-3的产量成为国内外研究重点。本研究采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术,并结合24深孔板发酵及以线黑粉酵母(Filobasidium uniguttulatum)为指示菌的高通量生物测定筛选技术,最终筛选到两株AP-3产量稳定提高15%的珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的突变株——M13和M144。并对高通量生测筛选技术进行了优化,最终确定实验过程的最佳参数:在液体摇瓶YPD中培养15 h时线黑粉酵母指示菌株可达到对数生长中期,且当摇瓶转接至孔板的接种量为10%时,指示菌与AP-3混合培养至30 h达到稳定期,可以明显观察到指示菌在0.2~0.7μg/mL AP-3浓度范围内的线性生长变化,酶标仪OD_(600)读数与AP-3浓度之间的标准曲线为y=0.0228x+1.8377,R^(2)=0.9906。以AP-3产量提高15%作为筛选指标,可筛选出高产突变株。对经高通量生测筛选出的突变株经10轮传代发酵后,最终筛选出两株AP-3产量稳定提高的突变株M13和M144。经二代重测序后,可定位突变株内部的突变位点,为今后从全基因组层面解析AP-3的高产原因,以及建立珍贵束丝放线菌ATCC31280的代谢网络提供理论基础。

基因组重排提高珍贵橙色束丝放线菌中安丝菌素P-3

安丝菌素P-3(ansamitocin P-3,AP-3)是一种具有高抗肿瘤活性的安莎类抗生素,为了进一步提高AP-3高产菌的产量,开展了利用基因组重排技术提高AP-3发酵水平的研究。首先对AP-3生产菌珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)原生质体制备、处理、融合条件进行了初步优化,然后以常温常压等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变技术得到的高产菌株L-40、L-117、L-506、L-522作为出发亲本进行三轮基因组重排,通过高通量筛选最终筛选出一株高产融合子G3-96,其AP-3产量约为335.9 mg/L,该菌株AP-3产量比亲本提高了47.5%,比野生型菌株提高了93.8%。实验结果表明基因组重排对于产物产量的提升是个非常不错的策略,为发酵生产合成提供了良好的菌株基础。

安丝菌素P-3的发酵工艺

考察了珍贵橙色束丝放线菌SIPI-3-21生产安丝菌素P-3(AP-3)的发酵工艺。首先优化了摇瓶发酵培养基配方,在含葡萄糖20.0 g/L、玉米淀粉30.0 g/L、棉籽饼粉30.0 g/L、CaCl2 10.0 g/L和CaCO3 5.0 g/L的发酵培养基中发酵培养9 d,AP-3产量为123.2 mg/L。进一步在摇瓶中考察了前体异丁醇对AP-3合成的影响,结果表明,添加异丁醇可以显著提高AP-3的产量。当其添加浓度为54 mmol/L时,AP-3的产量为307.8 mg/L,同时发酵液中AP-3的含量从57.2%提高到86.5%。

珍贵橙色束丝放线菌生产安丝菌素P-3的发酵工艺

将安丝菌素P-3(1)产生菌珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的紫外诱变高产菌株A.pretiosum SIPI-U-7 6,通过5 L发酵罐进行小试工艺研究,表明搅拌剪切力对1产量有明显的影响。采用降低搅拌转速、减少种子培养时间和调整发酵配方的方法,在5 L发酵罐上1的发酵单位可优化达到378 mg/L。将优化后的小试工艺放大至500 L和1 000 L罐上,发酵单位分别达到288和317 mg/L,较未优化的5 L发酵罐上的1发酵单位(23 mg/L)提高了11.5倍和12.8倍,实现了1的规模化生产。

适应性进化与甜菜碱的添加促进安丝菌素的生产

【背景】安丝菌素是一类由珍贵束丝放线菌橙色亚种(Actinosynnema pretiosum ssp.auranticu)生产的美登素类衍生抗生素,属于大环内酰胺类物质,根据不同的C-3位基团可以分为一系列衍生物。目前已上市的高效抗癌药物曲妥珠单抗(T-DM1)以AP-3 (Ansamitocin P-3)为生产底物,并表现出很好的乳腺癌治疗效果。然而当前AP-3的产量较低,其过高的成本限制了进一步发展。【目的】应用适应性进化及添加适量甜菜碱策略提高安丝菌素AP-3的产量。【方法】以珍贵束丝放线菌橙色亚种为出发菌株,链霉素和巴龙霉素为胁迫压力进行适应性进化,筛选出安丝菌素积累较高的菌株,随后向进化菌株的发酵培养基中添加0.1%的甜菜碱,AP-3的产量进一步提高,同时分析了进化菌株AP-3相关基因的转录水平,初步探索进化菌株安丝菌素积累提高的原因。【结果】得到2株进化菌株Str16-4-4和Par16-2-1,发酵7d后AP-3产量分别提高了33.4%和31.7%,添加甜菜碱后其AP-3产量相比出发菌株提高了54.6%和47.4%。【结论】通过适应性进化的策略获得了AP-3生产能力提高的珍贵束丝放线菌橙色亚种进化菌株,对促进AP-3的生产提供了新思路,而且为适应性进化策略提高目标产物的产量提供了新的例证。