超高效液相色谱-行波离子淌度串联四极杆飞行时间质谱仪高分辨质谱技术在重组人血白蛋白质量控制上的应用研究

目的应用超高效液相色谱-行波离子淌度串联四极杆飞行时间质谱仪(UPLC-VION)高分辨质谱联用技术对不同表达体系重组人血白蛋白和不同生产工艺下人血白蛋白在完整蛋白水平进行分析,探讨质谱分析技术在白蛋白产品鉴别实验上的实际应用。方法采用ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统,ACQUITY UPLC BEH C4色谱柱脱盐处理,电喷雾离子化(ESI)VION IMS QTof高分辨率质谱和UNIFI软件,对重组和血浆来源人血白蛋白进行分析。质谱信号经Max Ent1去卷积化软件处理后,获得样品平均相对分子质量以及相对强度图谱。样品包括血浆来源人血白蛋白(2个厂家)、酵母表达系统(毕赤及酿酒酵母)生产的重组人血白蛋白(3个厂家)、转基因水稻表达的重组人血白蛋白(1个厂家)共6批,分别进行了测定和数据分析。结果 UPLC-VION高分辨质谱联用分析结果显示,不同厂家和不同表达载体纯化得到的重组人血白蛋白均能检测到66 437的信号,误差低于1,与人血白蛋白理论序列平均相对分子质量一致;不同厂家和不同工艺的样品具有特征性的质谱图,即不同来源人血白蛋白具有不均一性。结论 UPLC/VION超高效液相色谱-质谱联用方法专属性好,灵敏度高,能够区分出不同厂家及不同工艺得到的重组或血浆来源人血白蛋白,可作为白蛋白类药品质量控制的鉴别实验方法。

液质联用(LC／MS)技术在单克隆抗体(曲妥珠单抗)结构表征上的应用

目的:应用LC/MS(液质联用)和LC/MSE方法(液相色谱/非数据依赖二级质谱数据采集方法,等频率切换高与低碰撞能量进行质谱数据扫描)对单克隆抗体(曲妥珠单抗,人源化单克隆免疫球蛋白IgG1)的结构进行深度表征。方法:先用LC/MS对曲妥珠单抗完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量进行测定;然后用多种酶(胰蛋白酶和AspN)酶解蛋白并用LC/MSE肽图分析法对曲妥珠单抗的氨基酸全序列进行解析和确定,同时对可能发生的翻译后修饰(PTMs)进行定性和定量分析。再通过PNGase F酶来释放抗体上的糖链并应用LC/FLR/MS(液相色谱荧光检测与质谱联用)方法对其糖基化修饰进行结构分析及确认。结果:对曲妥珠单抗的完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量测定得到良好的质量准确度,由此可判定特定蛋白修饰在轻链和重链上的分布。通过对曲妥珠单抗酶解后的氨基酸全序列确认,可对其翻译后修饰以及可能的错误氨基酸序列进行解析。该抗体肽图分析的氨基酸序列覆盖率是100%。糖基化分析是通过对游离的N-链接寡糖进行2-AB荧光标记后再用LC/FLR/MS(液相色谱荧光检测与质谱联用)方法来进行的。联合使用这些分析方法,能够有效地对不同批号和不同工艺的抗体药物进行常规质量检测和深度表征,控制药物质量,为患者提供安全可靠的生物治疗药品。结论:结合液质联用(LC/MS和LC/MSE)技术,通过完整蛋白相对分子质量的测量,肽图分析测定氨基酸序列以及翻译后修饰的定性和定量分析,结合游离N-链接寡糖的分析表征,对单克隆抗体曲妥珠单抗进行了全面的结构表征,并建立了一套单克隆抗体结构表征的平台化方案。