病原宏基因组高通量测序生物信息学分析质量评价的研究现状与思考

病原宏基因组高通量测序(mNGS)技术已成为感染病原学诊断的新工具,由实验操作(湿实验)和生物信息学分析(干实验)两部分组成。干实验由算法和数据库构成,其功能是对湿实验产生的测序数据进行分析处理后输出检测结果。干实验的性能受到测序数据中复杂多变的干扰因素的影响,包括临床样本中大量的人源核酸、试剂与耗材携带的微生物核酸、采样与湿实验引入的环境微生物核酸、数据库中基因组质量不均一或不同物种基因组之间的相似性过高导致的错误比对与注释,以及算法与参数差异对分类鉴定的影响等。上述干扰因素可能来自mNGS检测各个环节,不仅可能导致干实验输出错误的物种鉴定和微生物检测结果,也给干实验的质量控制与评价带来较大挑战。本文综述了mNGS干实验质量控制的关键问题以及关于质量评价方法的思考。

Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序对菌阴肺结核的诊断价值分析

目的探讨Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序对菌阴肺结核的诊断价值。方法回顾性分析2019年12月至2022年5月诊断为菌阴肺结核的70例患者,分别进行XpertMTB/RIF检测、宏基因组高通量测序及二者联合检测。采用固体培养法和比例法对生化病原菌进行诊断并分析诊断效能。采用预测值绘制受试者操作特征曲线。结果Xpert MTB/RIF诊断阳性率75.57%,阴性率21.43%;宏基因组高通量测序诊断阳性率78.57%,阴性率21.43%;联合诊断阳性率88.57%,阴性率11.43%。Xpert MTB/RIF检测敏感度为77.55%、特异性为59.86%,曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.827;宏基因组高通量测序检测敏感度为77.47%、特异性为61.02%,AUC为0.808;联合检测敏感度为89.75%、特异性为89.57%,AUC为0.925。结果显示Xpert MTB/RIF联合宏基因组高通量测序在菌阴肺结核中诊断的敏感度、特异性均高于单一检测(P<0.05)。结论XpertMTB/RIF联合宏基因组高通量测序在菌阴肺结核诊断中具有较好的应用价值,值得临床推广使用。

宏基因组高通量测序技术在中枢神经系统感染性疾病中的临床价值分析

目的 探讨宏基因组高通量测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技术在中枢神经系统感染性疾病诊断中的临床价值。方法 依托中国医学科学院北京协和医院感染性疾病宏基因组检测平台,回顾性分析2022年4—12月临床诊断为中枢神经系统感染性疾病患者的临床信息、常规实验室检测结果及mNGS结果等相关资料,评价mNGS技术在中枢神经系统感染性疾病诊断中的价值。结果 在39例临床诊断为中枢神经系统感染性疾病的患者中,29例(74.4%)检出疑似致病病原体特异性序列,其中11例(37.9%)检出细菌,13例(44.8%)检出病毒,3例(10.3%)检出真菌,1例(3.5%)检出细菌及病毒,1例(3.5%)检出真菌及病毒,真阳性率为74.4%。10例报告阴性结果,假阴性率为25.6%。mNGS技术的阳性率明显高于临床常规病原学检查(包括脑脊液涂片、培养、病原体抗原及核酸聚合酶链式反应)的阳性率(74.4%比23.7%)。结论 相较于现有的临床常规病原学检查手段,mNGS技术在中枢神经系统感染性疾病诊断中具有更高的真阳性率,可能有助于中枢神经系统感染性疾病的早期诊断。

病原宏基因组高通量测序技术质量评价参考品的建立

目的建立医疗机构病原宏基因组高通量测序(mNGS)本地化检测质量评价所需参考品。方法10种微生物按1∶10梯度稀释3个浓度水平后,分别与临床样本相近的人源细胞浓度混合。人源细胞按1∶10梯度稀释3个浓度水平后,分别与低浓度微生物混合。对参考品冻融稳定性进行研究。结果D1系列参考品包含:人源细胞为10^(5) cells/mL,微生物约为10^(5)~10^(3) CFU/mL的D1⁃1~D1⁃3以及不含微生物的D0;微生物约为10^(3) CFU/mL,人源细胞为10^(5)~10^(3) cells/mL的D1⁃3、D1⁃2(10)和D1⁃1(100)。D2系列参考品与D1系列设置相同。对参考品进行检测(以D1系列为例):D1⁃1~D1⁃3各检测1次,参考品中微生物均检出、其他微生物未检出;D1⁃2重复检测3次,各微生物检出序列数的变异系数为18%~49%;D1⁃1~D1⁃3以及D1⁃3、D1⁃2(10)和D1⁃1(100)两组参考品中各微生物检出的序列数的线性相关系数|r|为0.86~0.96。参考品冻融2次后检测,各微生物的检出序列数均下降。结论建立了包含10种微生物的参考品及其使用方法,可用于医疗机构mNGS本地化检测质量评价。

宏基因高通量测序辅助诊断鹦鹉热衣原体引起肺炎的价值

目的鹦鹉热衣原体感染人类后可引起严重的临床表现,宏基因高通量测序的方法可以为鹦鹉热衣原体引起的肺炎的诊断提供了重要的价值。方法对浙江省台州恩泽医疗集团附属台州医院及恩泽医院2019年12月—2021年10月收治的4例鹦鹉热衣原体感染肺炎患者进行回顾性分析,分析4例患者的临床表现、与禽类是否有接触史、实验室检查的相关指标、不同时期影像学的特征、宏基因高通量测序的结果、临床的治疗经过及治疗结果等,从而为鹦鹉热衣原体肺炎的诊疗提供临床经验。结果4例患者实验室检查指标:白细胞计数(WBC)轻微升高或正常;降钙素原(PCT)以及中性粒细胞比例(Neut比例)均增高;C-反应蛋白(CRP)明显增高,丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)等心肌酶指标均有不同程度的升高;影像学结果显示:胸部CT表现为肺部有不同程度的斑片实变影,部分患者有少许胸腔积液,多数患者为单侧病变,也可为双侧病变。经过对症治疗数日后,对4例患者复查胸部CT,结果显示病变部位明显缩小,治疗有效。对所有的患者进行宏基因高通量病原微生物DNA的基因检测,结果均检测出鹦鹉热衣原体。患者经3 d~4 d的抗感染治疗后,体温降至正常,总病程19 d~31 d。结论鹦鹉热衣原体引起的肺炎患者病情严重,辅助宏基因高通量基因测序检测后,经合理救治,患者愈后良好。

病原宏基因组高通量测序医疗机构本地化质量评价联合研究

目的:开展病原宏基因组高通量测序(mNGS)质量评价联合研究,为医疗机构(医院mNGS本地化建设提供参考经验。方法:参加单位使用本地化建设的mNGS流程,按方案要求检测参考品标本并回报结果。对检测性能及技术选型等因素进行统计分析。结果:来自全国17个省、直辖市的42家医院的47个科室参加本次研究,检测流程包括3种测序平台的10种测序仪。参加单位按研究方案完成质量评价参考品的测试,共回报49组有效数据,其中全部性能指标均为满分的占29%,各性能指标的满分占比分别为阳性符合率(准确性)73%、阴性符合率(特异性)92%、重复性47%、检出限71%,以及稳健性37%。实验流程中标本前处理、病原富集及核酸片段化的技术选型,是显著影响满分率的因素。更大的测序数据量与满分率呈正相关,而不同测序方案则无统计学差异。结论:本次联合研究提示,目前mNGS流程的整体稳定性仍有较大优化空间,实验室在开展本地化建设时应充分考虑影响检测系统稳定的各潜在因素,有助于保证日常运行的稳定可控。

利用宏基因组高通量测序技术揭示血液病患者的感染谱

背景感染是血液病患者常见的并发症和死亡原因,病原微生物的早期检测对于改善血液病患者的预后尤为重要。近年来出现的宏基因组高通量测序(mNGS)技术具有操作简单、所需样本量小、检测快、不易受污染、可检测出培养法不能检测的边缘微生物的优点。目的探讨mNGS技术检测所揭示的感染谱,以明确血液病患者的感染病因并指导治疗。方法标本来源于2018年8月至2020年12月广西医科大学第一附属医院血液科住院期间出现感染或疑似感染症状的53例血液病患者,对53例患者的58个样本(全血、脑脊液、胸腔积液、组织、腹腔引流液、关节液、痰液、右下肢穿刺液)进行mNGS技术检测。在进行mNGS技术检测的同时,52例患者(55个样本)采用培养法检测致病微生物、46例患者(50个样本)采用G/GM试验检测致病微生物、44例患者(48个样本)采用PCR检测致病微生物。结果mNGS所揭示的血液病患者的感染谱显示,革兰阳性菌中最常见为痤疮丙酸杆菌(42例次)、表皮葡萄球菌(33例次)、人葡萄球菌(32例次),革兰阴性菌中最常见的为约翰逊不动杆菌(26例次)、越南伯克霍尔德菌(20例次)、乌汶克霍尔德菌(19例次),真菌中最常见的为限制性马拉色菌(28例次);病毒中最常见的为巨细胞病毒、EB病毒、细环病毒(分别为26、14、19例次)。1例重型地中海贫血造血干细胞移植后患者血液及脑脊液均检出刚地弓形虫。与培养法、G/GM试验、PCR相比,mNGS技术具有较高的阳性率(P<0.05)。本研究中根据mNGS技术检测结果调整用药的患者有6例,其中4例经治疗好转,2例治疗效果欠佳。结论本研究利用mNGS技术揭示了血液病患者感染的病原体谱,证实mNGS技术可有效帮助确定血液病患者感染病因和指导治疗,但其可能出现假阳性和假阴性,结合其他检测方法可降低错误诊断的机会。

经肺泡灌洗液高通量测序诊断婴儿肺孢子菌肺炎1例并文献复习

目的探讨肺孢子菌肺炎的病因、临床表现、病原学诊断和治疗。方法回顾分析1例肺孢子菌肺炎患儿的临床资料。结果患儿,男,2个月20天,临床表现为慢性咳嗽、气促、烦躁、低氧血症;肺部影像呈双肺弥漫性浸润改变;经支气管镜术取肺泡灌洗液进行宏基因高通量测序后证实为肺孢子菌感染。确诊后予甲氧苄胺嘧啶-磺胺甲噁唑(TMPSMZ)治疗,临床症状基本消失,肺部CT明显好转。结论肺泡灌洗液行宏基因高通量测序可诊断肺孢子菌肺炎。

宏基因组高通量测序诊断血液病患者侵袭性真菌病研究

目的评价以宏基因组高通量测序(mNGS)诊断血液病患者中侵袭性真菌病(IFD)感染的临床特点及相关风险因素。方法纳入2022年1月至2023年1月70例住院血液病患者,疑诊IFD者行mNGS及真菌病原学检查,对比32例检出真菌感染者(IFD组)和38例非IFD组之间的临床特点和实验室数据。结果经mNGS检测确定的IFD组发现念珠菌15例(47%)、曲霉菌6例(19%),根毛霉菌4例(12.5%)和孢子菌4例(12.5%),其他3例(9%)。血液标本36例中经m NGS检出11例(30.6%)阳性;而真菌微生物培养仅3例(8.3%),阳性检出率差异具有统计学意义(P=0.017)。经多因素logistic回归分析,与IFD相关的风险因素为CD4+细胞计数低于400个/μL[OR 7.43,95%CI 7.43(2.46~22.44),P<0.001]、C反应蛋白增高[OR 3.71,95%CI 3.71(1.33~10.32),P=0.01]、IL-6升高[OR 6.5,95%CI 6.50(2.27~18.62),P<0.001]、IL-10增高[OR 3.03,95%CI 3.03(1.03~8.94),P=0.041]、低白蛋白血症[OR 7.04,95%CI7.04(1.40~35.56),P=0.025]及粒细胞缺乏持续10 d以上[OR 3.03,95%CI 3.03(1.03~8.94),P=0.002]。结论mNGS检测血液病患者中IFD敏感性高;CD4+细胞计数低于400个/μL、C反应蛋白增高、IL-6升高、IL-10增高、低白蛋白血症及粒细胞缺乏持续10 d以上是血液病患者发生IFD的独立风险因素。

宏基因组高通量测序在肺部感染中的应用

肺部感染可由细菌、病毒、真菌等多种病原体引起,是呼吸系统最常见的疾病,也是全球范围内重要的死亡原因之一[1]。由于传统病原学检测存在一定局限,临床约有30%~60的肺部感染患者无法明确病原学诊断,导致病情延误或抗生素滥用,快速准确的鉴定病原体是临床诊疗的关键[2]。

宏基因组高通量测序在免疫缺陷患者肺部感染诊断与治疗中的应用价值

目的评价宏基因组高通量测序(mNGS)在免疫缺陷患者肺部感染诊断与治疗中的应用价值。方法回顾性选取2018年11月至2022年5月在解放军总医院呼吸与危重症医学部第一医学中心重症监护室的78例免疫缺陷肺部感染患者[男55例,女23例,年龄(50.3±16.9)岁]和61例非免疫缺陷肺部感染患者[男42例,女19例,年龄(63.6±15.9)岁]。两组患者在临床诊断为肺部感染的同时,均行支气管肺泡灌洗液(BALF)的mNGS及常规微生物学检测(CMTs)。比较两种检测方法的诊断阳性率、病原体检出率以及与临床符合率的差异。同时比较两组患者根据mNGS检测结果抗感染治疗策略调整率的差异。结果免疫缺陷组与非免疫缺陷组肺部感染患者mNGS诊断阳性率分别为94.9%(74/78)和82.0%(50/61),CMTs诊断阳性率分别为64.1%(50/78)和75.4%(46/61),免疫缺陷组mNGS与CMTs诊断阳性率差异有统计学意义(P<0.001)。mNGS在免疫缺陷组中耶氏肺孢子菌、巨细胞病毒的检出率分别为41.0%(32/78)、37.2%(29/78),在非免疫缺陷组中肺炎克雷伯菌、鹦鹉热衣原体、嗜肺军团菌的检出率分别为16.4%(10/61)、9.8%(6/61)、8.2%(5/61),均高于CMTs的1.3%(1/78)、7.7%(6/78)、4.9%(3/61)、0、0(均P<0.05)。免疫缺陷组mNGS、CMTs与临床符合率分别为89.7%(70/78)、43.6%(34/78),差异有统计学意义(P<0.001)。非免疫缺陷组mNGS、CMTs与临床符合率分别为83.6%(51/61)、62.3%(38/61),差异有统计学意义(P=0.008)。免疫缺陷组根据mNGS病原学结果,抗感染治疗策略调整率为87.2%(68/78),非免疫缺陷组抗感染治疗策略调整率为60.7%(37/61),差异有统计学意义(P<0.001)。结论在免疫缺陷肺部感染患者中,与CMTs相比,mNGS在诊断阳性率、混合型感染诊断率、病原体检出率及指导抗感染治疗策略的调整方面更具优势,值得临床推广应用。

基于宏基因组高通量测序分析1起聚集性新型冠状病毒感染疫情的基因组及传播特征

目的分析包头市新型冠状病毒感染者的病毒基因组序列,了解新型冠状病毒在病例间传播过程中基因组的突变特征,探索新型冠状病毒在聚集性人群中的传播规律。方法采集2020年1月25日至2月21日包头市确诊的10例新型冠状病毒感染者的9份咽拭子样本(1~7、9、10号),2份痰液样本(8、11号,11号样本来自10号病例)及1份物表涂抹物样本(12号,来自10号病例),1、3号样本为单发病例样本,其余样本为聚集性病例样本。采用宏基因组高通量测序(mNGS)进行病毒基因组测序,与新型冠状病毒参考毒株NC045512序列比对筛选单核苷酸多态性(SNP)突变位点;并结合流行病学相关信息,进行基因突变、病毒分型和进化溯源分析。结果病毒基因组mNGS结果显示,与参考毒株NC045512序列比对,12份样本共检出76个SNP突变位点,突变类型包括转换3个(3.95%)、颠换73个(96.05%);包含19个(25.00%)同义突变和57个(75.00%)非同义突变。核苷酸及氨基酸变异位点分析结果显示,在全部聚集性病例(2、4~10号病例)中,T2821C、C6548T、T16464C、G16858A、T251C 5个位点均出现突变;单发病例1号样本在C9245T和A15340T位点、3号样本在C13T位点出现突变。病毒分型分析结果显示,1、3号样本均属于新型冠状病毒L型,其余样本均属于新型冠状病毒S型。基因组进化关系分析结果显示,所有样本可分为2个分支,1、3号样本分支属于单发病例,其余样本分支属于家庭聚集性病例。结论包头市新型冠状病毒感染聚集性病例基因组特征与流行病学调查结果基本吻合,病毒的传播主要与近距离接触和家庭聚集有关。

应用宏基因组高通量测序技术诊断急性片形吸虫病1例

片形吸虫病是一种人畜共患寄生虫病,人类感染较为罕见。因其临床表现不具有特异性、发病率低且诊断困难易被误诊,导致治疗延误及不必要的手术干预。临床诊断需血清学检测提示抗片形吸虫IgG抗体阳性,确诊通常根据粪便或十二指肠引流液检查见片形吸虫虫卵或者病理切片检查见片形吸虫虫体。现报道1例由宏基因组高通量测序技术诊断的急性片形吸虫感染患者,以期为该病的诊断提供新思路。

宏基因组高通量测序诊断肾移植术后华支睾吸虫感染一例

肾移植术后免疫抑制强度的增加,使受者对各类病原体表现出高度临床易感性。在实体器官移植领域,国内外仅有肝移植术后华支睾吸虫感染相关案例报道,且多为供者来源性感染(donor-derived infection,DDI)[1]。目前,基于宏基因组高通量测序(metagenomic next generation sequencing,mNGS)技术的广谱病原微生物筛查已逐渐应用于临床感染的辅助诊断。本研究通过回顾性分析南方医科大学南方医院1例应用mNGS辅助诊断的肾移植术后华支睾吸虫感染患者临床资料,分析其临床特点和治疗经验,为肾移植术后寄生虫感染的早期诊断与防治提供经验。

宏基因组高通量测序在猪链球菌感染中的应用1例

报道1例由宏基因组高通量测序技术(mNGS)诊断的猪链球菌败血症并链球菌中毒性休克综合征。患者男,50岁,于2021年6月25日就诊南方医院增城院区,流行病学史典型,主要临床表现为发热、腹泻、休克,结合血液mNGS诊断为猪链球菌败血症并链球菌中毒性休克综合征。初始采用美罗培南经验性治疗,mNGS结果回报后调整抗菌药物为美罗培南联合克林霉素,后续感染好转,降级抗菌药物为哌拉西林他唑巴坦联合克林霉素。猪链球菌后续经血培养确证。患者后期出现双足足趾干性坏疽和突发性耳聋,经治疗后好转出院。mNGS与传统诊断技术相比,具有及时性和准确性等优势,在严重感染和罕见病原体感染领域中起着关键作用。建议将mNGS和传统的诊断技术相结合,早期诊断、早期治疗。

宏基因组高通量测序诊断新生儿单纯疱疹病毒性脑炎1例

报告1例通过宏基因组高通量测序技术(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)诊断的新生儿单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)Ⅱ型感染性脑炎。患儿主要表现为发热、抽搐,脑脊液白细胞增高、单核细胞为主、蛋白进行性增高,脑脊液HSV聚合酶链反应2次阴性,1次提示灰区,脑脊液细菌培养阴性,mNGS提示HSVⅡ型相对丰度94.27%。对于高度怀疑颅内感染的患儿,常规检测方法难以确定病原时,mNGS技术有助于明确病原体。

宏基因组高通量测序技术在感染性疾病病原诊断中的临床应用

目的探讨宏基因组高通量测序技术(mNGS)在感染性疾病病原诊断中的临床应用。方法通过具体分析mNGS在4个临床典型病例中的应用,探讨mNGS的临床应用适应证及如何正确地判读结果。结果病例1病情危重,进展迅速,考虑感染可能,但病原不明,通过mNGS方法迅速锁定目标病原为钩端螺旋体。病例2为结核杆菌感染,病原培养需要时间较长,且阳性率低,常规方法联合mNGS可明显提高诊断率。病例3显示mNGS敏感度高,可检测到微量的基因产物,但也不排除检测过程中的痕量污染。所以在临床诊治过程中,应联合常规检测方法,结合流行病学史、临床表现及治疗反应综合判断,甄别假阳性可能。病例4显示mNGS因其高度敏感,对几乎所有病原微生物可无差别检测,所以其阴性结果对于排除感染亦具有较高的阴性预测值。结论mNGS在感染性疾病的病原学诊断方面具有独特的优势,是传统病原学检测方法的有益补充。

五例宏基因组高通量测序诊断鹦鹉热衣原体肺炎的诊治及临床特点分析

目的分析和探讨高通量基因测序(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)诊断鹦鹉热衣原体肺炎病例的诊治及临床特点。方法2021年2月—3月华中科技大学协和深圳医院呼吸与危重症医学科及感染科连续收治5例诊断为鹦鹉热衣原体肺炎的患者,对其临床资料进行回顾性分析,总结mNGS的诊断价值及该病的临床特点及诊治要点。结果5例患者以高热、咳嗽为主要表现,4例有明确鹦鹉饲养史,白细胞、中性粒细胞正常或轻度升高,C反应蛋白、红细胞沉降率升高,胸部CT表现为某一肺叶或多个肺叶实变和渗出,严重者进展快,出现呼吸衰竭,经验性使用抗生素效果不佳。通过支气管肺泡灌洗液mNGS检出鹦鹉热衣原体核酸序列,结合临床特点明确诊断。支气管肺泡灌洗液mNGS检查病原体的准确率高,同时识别有无合并其他病原体的感染。更换为四环素类或喹诺酮类为主的治疗方案后病情明显好转,提高鹦鹉热衣原体肺炎的诊断率,缩短诊断时间和病程,减少不必要抗生素的使用。结论mNGS对鹦鹉热衣原体肺炎的诊断具有重要价值,能及时指导有效的抗生素治疗。

宏基因组高通量测序对中枢神经系统感染性疾病的诊断意义

探究宏基因组高通量测序(mNGS)对中枢神经系统感染性疾病的诊断意义。方法:选取2019年8月至2020年12月的70例中枢神经系统感染性疾病患者,腰椎穿刺留取脑脊液标本,分别行常规、生化以及宏基因组高通量测序。结果:70例患者临床确诊术后颅内感染60例,其中39例脑脊液 mNGS 测序(序列数分别为 212、329、1601 和 5371)和细菌培养(鲍曼不动杆菌 10 例、皮特不动杆菌11 例、产气肠杆菌18 例)均呈阳性;21 例经随访临床确诊术后颅内感染,但脑脊液 mNGS 测序和细菌培养均呈阴性。45例临床诊断为无菌性脑膜炎,其中20例脑脊液 mNGS 测序序列数 < 100;15 例脑室外引流管管头细菌培养为表皮葡萄球菌,但脑脊液 mGNS 测序呈阴性,随访后确认为污染所致。脑脊液 mNGS 测序诊断术后颅内感染的灵敏度为 4/8、特异度为 7/7,准确率为 11/15。结论: mNGS 测序诊断中枢神经系统感染性疾病有一定价值,可以作为传统检测方法的有效补充,但 mNGS 测序结果须结合临床实际情况合理判读。

以神经系统为首发症状的老年恙虫病1例诊治体会

恙虫病是一种急性自然疫源性传染病,主要由恙虫病东方体感染引起,好发于南方,北方地区比较少见,但近年来我国恙虫病的流行地区逐渐由南向北扩展。该病临床表现多样,多表现为发热、皮疹、淋巴结肿大,焦痂对于诊断具有较高特异性。部分患者临床症状不典型,可伴有神经系统症状,容易漏诊或误诊,延误病情。当患者无特异性临床表现,且传统血清学检测不能明确诊断时,宏基因组高通量测序(mNGS)有助于快速诊断,提高治愈率,改善预后。