微生物宏蛋白质组从样品处理、数据采集到数据分析

微生物与人体疾病、健康密切相关,如何理解微生物群落的组成及其发挥的功能是一大亟需研究的问题。近年来,宏蛋白质组学已经成为研究微生物组成与功能的重要技术手段。然而,由于微生物群落样本的复杂性与高度异质性,样品处理、质谱数据采集与数据分析成为宏蛋白质组目前面临的三大挑战。在宏蛋白质组分析中往往需要针对不同类型的样品进行前处理优化,采取不同的微生物分离富集、提取和裂解方案。与单一物种蛋白质组相类似,宏蛋白质组学中的质谱数据采集模式有数据依赖性采集(data-dependent acquisition,DDA)模式和数据非依赖性采集(data-independent acquisition,DIA)模式。DIA数据采集模式可以完整地采集样品的肽段信息,具有很强的发展潜力。但是由于宏蛋白质组样品的复杂性,其DIA数据解析已成为阻碍宏蛋白质组深度覆盖的一大难题。在数据解析方面,最重要的步骤在于蛋白质序列数据库的构建。数据库的大小和完整性不仅对鉴定数量有很大影响,还会影响物种和功能水平上的分析。目前宏蛋白质组数据库构建的金标准是基于宏基因组的蛋白质序列数据库。同时,基于迭代搜库的公共数据库过滤方法也已被证明具有很强的实用价值。从具体的数据解析策略角度,以肽段为中心的DIA数据解析方法占据了绝对的主流。随着深度学习和人工智能的发展,其会极大地推动宏蛋白质组数据解析的准确度、覆盖度与分析速度。在下游生物信息学分析方面,近年来开发了一系列注释工具,可以在蛋白水平、肽段水平、基因水平上进行物种注释来获得微生物群落组成。与其他组学方法相比,微生物群落的功能分析是宏蛋白质组学的一个独特特征。宏蛋白质组已经成为微生物群落多组学分析中的重要组成部分,并且仍在覆盖深度、检测灵敏度、数据解析完整度等方面具有很大的发展潜力。

豆酱微生物宏蛋白质组提取及分析

为了更进一步探索豆酱中微生物群体的功能,实验利用分步提取法,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,建立了豆酱微生物宏蛋白质组表达谱,并利用液相色谱-质谱/质谱联用技术对蛋白质进行鉴定。结果显示,共鉴定出232种蛋白质,可归为糖代谢60种、核酸代谢57种,蛋白质代谢48种,能量代谢15种,脂质代谢3种,其他功能蛋白质49种。来源于细菌的蛋白质数量几乎为来源于真菌蛋白质数量的3倍,其中细菌来源以枯草芽孢杆菌、明串珠菌、粪肠球菌、肠膜明串珠菌和德氏保加利亚乳杆菌为主,真菌来源以酿酒酵母、裂殖酵母、链孢霉、白腐菌和棉阿舒囊霉为主。

宏蛋白质组学：探索环境微生态系统的功能

宏蛋白质组学是近年来新出现的一种概念和研究技术,虽然现在已经开展的宏蛋白质组学的研究很少,但是在特殊极端环境中功能基因表达、特殊功能蛋白质的开发、生态元素循环等研究领域,宏蛋白质组学已经初步展示了其强大的功能.通过介绍并对比宏蛋白质组学常用研究技术和策略的优劣,发现在进行宏蛋白质组研究时,要根据研究对象和目的选取合适的研究技术和策略,才能达到预期的研究目标.宏蛋白质组学已经在少数生态环境的功能研究中取得了成功,也必将在深入认识环境微生物群落功能、新环境标志物发现和环境微生物相互作用等方面起到更大的作用.

绍兴黄酒麦曲制曲过程的宏蛋白质组学研究

麦曲在制曲的过程中,以小麦为原料,通过自然接种环境中的微生物,发生一系列的生物化学变化,最终生成黄酒酿造所需的各种粗酶制剂以及风味代谢物质的前体。该研究利用宏蛋白质组学的理论和方法,对绍兴黄酒麦曲制曲过程中6个不同时期(起始期、发酵前期、升温期、高温期、降温期、成熟期)的麦曲浸提液宏蛋白质组进行双向电泳实验,研究麦曲制曲过程中浸提液宏蛋白质组的变化情况。使用PDQuest软件对获得的双向电泳图谱进行比较分析,发现共有12个蛋白点在制曲过程中发生了动态变化。利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)对该12个差异蛋白点进行了质谱分析,其中7个鉴定成功,分别是来自一种稀有细菌的凝结因子5/8型功能蛋白,微单孢菌属的苹果酸脱氢酶,糖红孢红霉菌的葡萄糖-6-磷酸异构酶和羧肽酶前体蛋白,外子藻的功能未知蛋白以及小麦的木聚糖酶抑制剂和几丁质酶。

基于唾液宏蛋白质组学的重度低龄儿童龋患者唾液微生物群落分析

目的采用宏蛋白质组学技术研究重度低龄儿童龋患者唾液微生物群落的特征。方法采集重度低龄儿童龋及无龋儿童非刺激性唾液,提取唾液中的蛋白质、酶解形成多肽后进行质谱分析,对比微生物库分析唾液微生物群落的特征。结果无龋儿童唾液微生物来源于19个门1 216个种,高丰度的微生物以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、梭杆菌门以及乳糖奈瑟氏菌、肺炎链球菌、干燥奈瑟氏菌、副流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、浅黄奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、金氏金菌、黏膜奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌等11种细菌为主;重度低龄儿童龋儿童唾液微生物来源于24个门1 698个种,高丰度的微生物以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻菌门以及肺炎链球菌、乳糖奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌等4种细菌为主。结论宏蛋白质组技术可以全面、快速分析口腔唾液微生物群落的构成。重度低龄儿童龋儿童唾液微生物群落结构相比无龋儿童更加复杂,这种复杂性可能与龋病的产生及唾液微生态失衡有关。

宏蛋白质组学研究进展及应用

宏蛋白质组学是近几年出现的一种应用蛋白质组学方法对环境微生态系统进行研究的一种新技术,已在环境生态领域研究中展示出了强大的功能。文中综述了宏蛋白质组学的研究技术及策略、介绍了其在污水生物处理、土壤及发酵食品微生物群落结构分析中的应用,并对其在环境微生态领域中的研究进行了展望。

宏蛋白质组学:研究微生物群落的一种新策略

宏蛋白质组学是一种运用蛋白质组技术对特定微生物群落所产生的全部蛋白质进行大规模研究与分析的新技术。简要概述宏蛋白组学的产生、研究策略及其应用情况,并对其应用前景进行展望。

宏蛋白质组学——研究微生物群落基因表达的新技术

宏蛋白质组学是应用蛋白质组学技术对微生物群落进行研究的一项新技术,其定义为在特定的时间对微生物群落的所有蛋白质组成进行大规模鉴定。通过对宏蛋白质组学的研究策略、进展情况的综述、介绍,展望了宏蛋白组学在研究微生物群落基因表达中的应用前景。

绍兴黄酒熟麦曲制曲过程的宏蛋白质组学研究

熟麦曲是将小麦蒸熟后,接种纯种米曲霉,调节适宜温湿度,促使其在曲料上生长繁殖并积累代谢产物,完成制曲过程。该研究利用宏蛋白质组学理论和方法,对绍兴黄酒熟麦曲制曲过程中4个不同时期(孢子萌芽期、菌丝生长期、菌丝繁殖期、孢子着生期)的麦曲浸提液宏蛋白质组进行双向电泳实验,研究麦曲制曲过程中浸提液宏蛋白质组的变化情况。使用PDQuest软件对获得的双向电泳图谱进行比较分析,发现共有5个蛋白点在制曲过程中发生了动态变化。利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)对该5个差异蛋白点进行了质谱分析,全部来自米曲霉分泌的α-淀粉酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶Ⅱ、碱性蛋白酶和葡萄糖淀粉酶B。

汾酒大曲宏蛋白质组的制备与双向电泳技术的建立

采用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀、硫酸铵等沉淀法制备汾酒大曲的宏蛋白组样品,并用双向电泳来检测制备效果,结果表明:TCA-丙酮沉淀法制备的样品经电泳分离后,减轻了杂质干扰,其2-DE图谱中竖条纹干扰较少,且获得的蛋白点形状规则、清晰且无明显重叠现象,优于其它两种方法;经过两次水化液溶解的蛋白样品在等电聚焦时能保持4000 V较高电压;上样量为300μg左右的粗蛋白溶于二次水化液能得到点数更多、分辨率高的电泳图谱。建立了汾酒大曲宏蛋白质组的双向电泳体系,为汾酒品质研究奠定基础。

土壤宏蛋白质组学之土壤蛋白质提取技术的发展

随着土壤宏基因组学的日益成熟和发展,作为后基因组时代重要技术平台的土壤宏蛋白质组学越来越受到关注。土壤宏蛋白质组学的研究是解析土壤宏基因功能的重要手段之一,对于碳氮磷的生物地球化学循环以及土壤有机质积累的研究具有重大价值,可将蛋白信息与相关的生态系统过程联系起来。但是,土壤蛋白含量少,样品复杂程度高,极大限制了土壤蛋白的分离提取和进一步分析。因此,通过改进和优化土壤蛋白的提取技术,得到高浓度的蛋白是土壤宏蛋白质组学研究的前提条件。本文总结了近几年来土壤蛋白提取方法,并对其适用的土壤性质以及适用的不同种类和功能的蛋白进行了分析。此外,本文也对现有的土壤蛋白提取技术以及土壤蛋白鉴定技术的方法改进进行了探讨。

绍兴黄酒熟麦曲的宏蛋白质组的样品制备方法研究

本研究以绍兴黄酒熟麦曲为研究对象,采用丙酮法和Clean Up Kit试剂盒法来处理样品,发现Clean Up Kit试剂盒法能够有效去除盐离子、多糖等干扰物质,蛋白点数目较多且清晰,无拖尾现象。蛋白样品上样量为90μg时,分离效果较好。初步建立适用于绍兴黄酒熟麦曲的宏蛋白质组的样品制备方法,获得了较好的双向电泳图谱。

基于两种预处理方法的白酒酒醅微生物宏蛋白质组学比较

分别采用离心-超声波破碎法(centrifugation-ultrasonic disruption,C-UD)和液氮研磨-超声波破碎法(liquid nitrogen grinding-ultrasonic disruption,LNG-UD)预处理浓香型白酒酒醅样品,采用Tris/酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法提取微生物蛋白质,利用非标记定量蛋白质组学技术比较两种预处理法获得的酒醅微生物群落结构差异。结果表明:两种预处理法提取的酒醅蛋白质含量差异不显著,但C-UD处理十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白条带数量更丰富且清晰。基于C-UD法获得的酒醅肽段及蛋白质数量高于LNG-UD法,且蛋白质鉴定结果的评分较高。两种预处理法获得的酒醅微生物种类及其群落结构有一定差异,且两者均与同一酒醅样品的基因组扩增子测序结果存在差异,提示整合多组学研究的必要性。研究结果有助于进一步优化酒醅微生物蛋白质的提取方法,为酿酒微生物宏蛋白质组学的深入研究奠定一定基础。

宏蛋白质组学信息分析的基本策略及其挑战

宏蛋白质组学是一门新型科学,它运用质谱技术规模化地采集自然界微生物种群的蛋白质信息,并结合多种组学数据,开展微生物种群的遗传特征及其生物功能的研究.宏蛋白质组学的信息分析与传统蛋白质组学方法有较大的不同,亟需拓展新的分析思路.由于宏蛋白质组的研究对象是复杂度极高的微生物样品,因此,需要构建尽可能囊括样本中所含微生物的基因组信息的物种数据库.面对庞大的数据库,必须考虑到分析过程中所消耗的计算资源和鉴定结果的质控标准,因此,需要高度优化库容量、搜库、假阳性控制等参数.鉴于宏蛋白质组数据中广泛存在复杂的同源蛋白质序列,因此,需要充分利用NCBI数据库中的分类信息进行匹配,并运用LCA算法过滤处理才能将蛋白质有效地归组到物种.本文立足于宏蛋白质组学信息分析,从宏蛋白质组的数据库建立、蛋白质归并、生物学意义发掘等几个方面着手,对该领域的发展现状、面临挑战以及未来研究方向进行了评述.

一种纤维素降解菌群的宏蛋白质组

应用液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)对一个能够降解纤维素的微生物群落FPDM在滤纸培养基中不同降解时间点的宏蛋白质组进行定性和定量分析,共检测到608种蛋白质,其中有40种为已注释纤维素酶,并观察到伴随纤维素降解过程的进行,纤维素酶的相对丰度变化与纤维素酶的功能相关。对宏蛋白质组的物种来源进行分析,表明群落FPDM主要由Sporocytophaga、Cohnella和Herbaspirillum组成,进一步分析发现分别是Sporocytophaga和Cohnella动态主导了纤维素在前中期与中后期的协同降解。通过短时间序列表达水平挖掘机(STEM)聚类分析的方法,预测了5种未被注释蛋白的功能,包含2种纤维素降解前中期相关蛋白与3种纤维素降解中后期相关蛋白。

HOMPPD:一个全面的人类口腔宏蛋白质组序列数据库

与宏基因组学相比,宏蛋白质组学可以系统地描绘微生物功能的动态变化,因此用其研究口腔微生物的组成和功能已成为一个新兴的领域。一个适当、完整的蛋白质组序列数据库在宏蛋白质组的数据分析中至关重要。在口腔宏蛋白质组研究中,常用的数据库为人类口腔微生物数据库(Human Oral Microbiome Database,HOMD),其中收录来自117个菌属和367个菌种的蛋白质组序列。但在近年来的口腔宏基因组研究中,已报道大量HOMD未收录的菌属。通过对宏基因组研究报道的95个菌属的蛋白质序列进行筛选和去冗余,然后与HOMD进行整合,构建一个更完整的人类口腔微生物蛋白质组数据库HOMPPD(Human Oral MetaProteome Plus Database);同时基于口腔微生物的高度个体化,提出对每个样本进行一次两步搜索的改进的两步检索法,最后利用已发表的唾液蛋白质组数据对其进行测试。通过整合,HOMPPD最终收录184个菌属和2 793个菌种的蛋白质组序列;测试结果表明,采用HOMPPD和改进的两步检索法可以鉴定到39个HOMD中未收录的新菌属和124个新菌种。新鉴定到的菌属主要分布在Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes三个门中。HOMPPD是目前为止收录蛋白质序列最全的口腔细菌蛋白质组数据库,使用其检索可以更加全面地鉴定唾液微生物的类群构成,其下载链接为ftp://111.198.139.72:4000//pub//metaproteomics//homppd.fasta。

宏蛋白质组学在酒曲酶学及蛋白组成功能研究中的应用

宏蛋白质组学技术能够对特定样品中微生物菌群代谢产生的全部蛋白质进行大规模研究,还能直观地揭示研究对象中微生物与代谢蛋白的功能及其相互关系,是未来解析酒曲中酶和蛋白质的组成及其功能、探究酒中风味物质的产生机理及提升其风味品质的重要手段和研究方向。本文综述了宏蛋白组学的研究方法及策略,介绍了其在酱香高温大曲、清香中温大曲及黄酒麦曲酶学及蛋白组成功能研究中的应用,并对其在酒曲研究中的应用作了展望。

宏蛋白质组学研究策略及应用

宏蛋白质组学是近年来出现的一种对天然环境微生态进行大规模蛋白质组学研究工作,其定义为对给定位点的环境微生物群落的所有蛋白质组成进行的即时的大规模的分析。以下将通过分析已有的宏蛋白质组学研究,并结合本研究组的研究经验,对本领域的研究策略、进展情况等加以综述。

宏蛋白质组学技术在废水生物处理工艺研究领域中的应用

随着后基因组时代的到来,宏蛋白质组学逐渐兴起并在生命科学基础领域和临床医药领域成功运用,宏蛋白质组学技术现已成为各研究领域炙手可热的方法之一.宏蛋白质组学技术在废水生物处理研究领域中的应用刚起步,但已展示其强大功能.本文主要综述近年来国内外宏蛋白质组学在废水生物处理研究领域的研究进展,回顾及总结了宏蛋白质组学的研究策略及应用,如鉴定功能性蛋白质/酶、揭示污染物的微生物降解途径、推断废水生物处理系统的关键代谢途径、及探讨不同污泥微生物群落微生态变化等.

土壤宏蛋白质组学蛋白质提取方法及其应用

土壤宏蛋白质组学在揭示土壤微生物功能、代谢与环境相互作用方面具有广阔的应用前景,但由于土壤样品的特殊性,土壤蛋白质提取步骤是限制土壤宏蛋白质组学大规模应用的瓶颈之一.本文从样品制备、提取方法、影响因素等方面综述了土壤蛋白提取方面的研究进展.一般来说,根据实验目的、蛋白种类及后续研究方法设计相应的分组成收集策略才能取得较好的提取效果.土壤总蛋白、胞内蛋白与胞外蛋白分别有不同的提取方法.总蛋白提取一般采用直接提取法;胞外蛋白不需要裂解;胞内蛋白提取方法有直接提取法和间接提取法等.裂解、浓缩、去除腐殖质的方法以及提取液、pH值的选择等也会影响提取效果.此外,简单介绍了土壤宏蛋白质组学的应用,并对今后的研究工作提出展望.