定向演化技术与蛋白质工程——解读2018年诺贝尔化学奖

2018年美国化学家Frances Arnold因在蛋白质的定向演化方面的开创性贡献获得了诺贝尔化学奖。定向演化是使用演化论的方法对蛋白质进行改造的一种方法。其基本步骤包括构建基因突变文库,表达突变体,然后根据所需要的蛋白质功能对突变体进行筛选。通过筛选的突变体再进行新一轮的突变和筛选。经多轮筛选有可能获得具有所期望功能或特性的蛋白质。目前,定向演化在提高酶的催化活性,改变酶的底物或产物专一性,以及对蛋白质的自然演化历程进行理论探索等诸多方面都有广泛的应用。

生物演化机制探讨

根据古生物系统演化资料和相关的生物资料,论述了生物本身是其演化的物资基础,突变起主导作用,渐变为辅。在生物系统演化过程中,普遍表现出间断平衡的演化形式;不同门类具有理想的相似造形本能;同一系统不同支系,具有同步定向的平行演化特性;地理隔离并不改变其固有属性以及绝灭特点等,都表明生物本身起主导作用,环境的作用是第二位的、次要的。自然选择对于系统演化中的基因突变是不起作用的。

基于卡那霉素抗性建立的研究Ⅰ类内含子结构与功能关系的系统

Ⅰ类内含子(group I intron)是研究RNAs结构与功能关系的理想元件,在解释RNA折叠理论、催化机制等方面起着重要作用;对其结构与功能关系的研究也因此成为一个非常重要的课题.本研究建立了一个基于卡那霉素抗性进行Ⅰ类内含子结构与功能关系研究系统,将源于海洋蓝细菌Nostoc punctiforme(Npu)核糖核酸还原酶基因(ribonucleotide reductase,Rir)中的1个Ⅰ类内含子插入到pDrive质粒的卡那霉素抗性基因(kanamycin resistance gene,KanR)内构建得pKR12质粒并转化大肠杆菌(E.coli).只有内含子剪接的阳性克隆才能生成KanR蛋白并在Kan抗性平板上生长.结果显示,pKR12转入E.coli后不能在Kan抗性平板上生长,RT-PCR检测仅可见前体带,表明插入到KanR中的Npu Rir内含子没有发生剪接.随后通过易错PCR建立内含子的随机突变库并用Kan抗性筛选进行定向演化,产生有剪接活性的内含子突变体,RT-PCR检测显示剪接发生.由于内含子剪接活性的改变可通过Kan抗性变化在LB平板上得以反映,因此该系统有望成为简单快速地研究Ⅰ类内含子结构与功能关系的有利工具.