菊苣叶绿体同源片段的克隆及多顺反子定点整合表达载体的构建

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计合成引物,从菊苣叶绿体基因组中扩增包括rps7-rps12-trnV-16S rDNA基因在内的一段序列(GenBank登录号为GQ199478),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以叶绿体基因强启动子prrn驱动选择标记基因aadA及报告基因gfp构建多顺反子表达盒prrn-aadA-gfp-psbA-3,′然后将表达盒克隆进菊苣叶绿体同源片段中,获得菊苣叶绿体定点整合表达载体pJAG,酶切分析证明所构建的载体符合预期设计。该载体的构建为建立菊苣的叶绿体转化体系奠定基础,为进一步通过叶绿体基因工程手段将更多感兴趣的基因导入菊苣进行遗传改良,或以菊苣叶绿体作生物反应器生产动物口服疫苗等搭建技术平台。

构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达

目的:构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体,并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达。方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原HAb18G胞外段基因,SacI/NotI双酶切后插入真核表达载体pCEL2f中,构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体基因的重组表达载体pCEL2f/HAb18GEF,并经酶切和测序验证。将此重组表达载体与POG44载体(按1∶9的比例混合后),在阳离子脂质体介导下共转染HEK293-16工程细胞,用潮霉素B筛选定点整合表达EpoR/LR-F3/HAb18GEFcDNA的细胞克隆。用间接免疫荧光染色法、流式细胞术及Zeocin致死试验,检测并验证稳定表达株中EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的表达。结果:成功地构建pCEL2f/HAb18GEF真核重组表达载体,共转染后EpoR、HAb18GEF均高效表达于转染的HEK293-16细胞的胞膜上。经潮霉素B筛选得到12株可融合高表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF的稳定株,其表达EpoR的阳性率为99.93%,平均荧光强度(MFI)为1036.39,表达HAb18GEF的阳性率为99.51%,MFI为652.72,且可被Zeocin致死。结论:成功地建立了表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的HEK293-16工程细胞株,为进一步利用哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱(MAPPIT)系统筛选HAb18G的作用受体奠定了基础。

转基因植物外源基因的整合分析

外源基因表达的不稳定性和多样性是制约转基因作物育种研发进度的关键因素,外源基因的整合情况与外源基因的表达直接相关,充分了解外源基因的整合情况可为构建高效表达载体、获得外源基因稳定一致表达转基因材料提供参考,同时为转基因作物的安全利用提供保障。就外源基因整合情况的分析方法、不同转化方法外源基因的整合特点及利用定点整合技术提高外源基因表达稳定一致性的研究进展作一概述。

构建结球甘蓝KIN基因在叶绿体基因组定点表达的载体

获得叶绿体基因组定点整合表达载体是开展结球甘蓝叶绿体基因组的遗传转化研究的第一步。本研究克隆了CMS结球甘蓝的抗冻蛋白KIN基因,发现该基因定位于结球甘蓝的2号染色体上。通过构建中间载体p KA和p AI,将KIN基因的编码区构建到了CMS结球甘蓝叶绿体基因组定点整合表达载体p IKAA中。该载体以Trn A和Trn I基因片段作为同源整合片段,能整合到CMS结球甘蓝叶绿体基因组中。此外,该载体是双顺反子形式的,即在转录的单条m RNA上,同时包含了KIN和aad A基因编码区。将p IKAA转化到大肠杆菌中,结果显示转化有该载体的大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素(AMP)和壮观霉素(SPEC)的固体LB平板中生长。研究结果可为后期CMS结球甘蓝叶绿体基因组的遗传转化体系的建立奠定基础。