蛋白质的非定点荧光标记——推荐一个化学生物学实验

本论文介绍了一项化学生物学实验,旨在利用异硫氰酸荧光素的异硫氰基与蛋白质氨基共价结合的原理,实现对体外蛋白(以牛血清白蛋白为例)和体内蛋白(以大肠杆菌总蛋白为例)的非定点荧光标记。实验采用凝胶过滤法作为后续纯化手段,并运用紫外-可见分光光度计、流式细胞术以及荧光显微镜对标记结果进行全面表征。该实验涵盖了多种基础和前沿实验技能,与科研工作中常见的抗体荧光标记技术密切相关,难度适中。通过参与这一实验,学生不仅能够深入理解化学生物学基础知识,提高综合实践能力,还能够拓宽科研视野并培养科研思维。

蛋白质定点标记的近红外荧光探针的合成研究

生物大分子定点标记的荧光探针可以用来研究蛋白质的结构和功能,荧光探针良好的刚性和高连接特异性对于使用荧光共振能量转移(FRET)实验来解析生物大分子动态学特征来说有着重要的意义。本文报道两种花菁素类荧光探针IAM-Cyanine3和IAM-Cyanine5的合成方法,该探针通过碘乙酰胺基团特异性地标记在生物大分子的巯基上,相对于商业化的产品,其连接蛋白后的探针分布更加紧密,更有利于对生物大分子的结构和动态学进行更加精确的描述。

非定点方法构建的靶向CLDN18.2探针^(68)Ga-NOTA-376的体内外性质评价

目的:以非定点标记的方法构建^(68)Ga标记的靶向CLDN18.2的正电子发射体层成像(positron emission tomography,PET)探针^(68)Ga-NOTA-376,并评价其体内外性质。方法:以p-SCN-Bn-NOTA为螯合剂,非定点偶联靶向CLDN18.2的纳米抗体376,得到前体NOTA-376,对偶联后的前体进行^(68)Ga放射性标记。通过放射性薄层色谱法(Radio thin layer chromatography,Raio-TLC)测定探针的标记率、放射化学纯度及体外稳定性,并进行探针在人胃腺癌小鼠模型的micro-PET/计算机体层成像(computed tomography,CT)显像实验。结果:^(68)Ga-NOTA-376显示出高标记率(89.98±0.07)%、高放射化学纯度(97.67±0.02)%以及较高的比活度(16.69±6.60)GBq/μmol,并且在5%人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)和磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)中保持稳定。Micro-PET/CT结果表明探针在CLDN18.2阳性肿瘤中的最大标准摄取值(maximum standard uptake value,SUVmax)显著高于CLDN18.2阴性肿瘤,4.0 h时CLDN18.2阳性肿瘤及CLDN18.2阴性肿瘤的SUVmax分别为9.08±0.33及1.92±0.32。结论:本研究以非定点标记的方法成功构建了靶向CLDN18.2探针^(68)Ga-NOTA-376,标记率高,具有良好的稳定性及靶向性,是一种有潜力的PET探针,可用于CLDN18.2蛋白表达水平的检测。

浅析纺织面料尺寸定点标记操作方法

本文主要研究纺织面料尺寸变化率测试前的尺寸定点标记、裁剪操作方法,引用5个较常用的标准要求进行测试,对人员手动与标记机自动化两种操作方法的工作耗时、面料实际标记尺寸偏差结果进行对比。试验结果表明,选用自动化打标记并快速切割面料的定点标记机,能大大提高工作效率,节约成本,减少人为的一些手动标记重复工作和尺寸裁剪误差,更进一步优化、提高检测技术水平。

超快多维红外光谱学:分子结构的时空分辨

利用时间分辨的超快二维红外(2DIR)光谱、稳态一维红外光谱等手段,本文探讨了从溶液中的小分子体系到生物大分子体系的超快振动特性及所反映的分子结构动力学过程。研究了五羰基溴化锰在四氯化碳中的时间分辨2DIR光谱,发现了分子对称性增强的13 CO配体的红外吸收信号,并利用2DIR对角峰和非对角峰表征了其与12 CO配体振动态的相互作用和分子内能量传递过程;实现了钌羰基配合物在光敏黄色蛋白突变体M100A上的定点标记,并研究了该外源标记物的羰基配体的结构动力学,发现了探针分子的振动光谱指纹对其所处的空间位置的敏感性,还发现该探针分子的振动扩散过程对水相中的蛋白质结构涨落具有灵敏性。

EPR波谱拟合-傅里叶去卷积距离计算方法

在蛋白质结构与功能研究中经常需要测量和计算蛋白质分子功能基团间的距离.电子顺磁共振(Electron Paramagnetic Resonance,EPR)结合定点自旋标记(Site Directed Spin Labeling,SDSL)技术已成为测量蛋白质特殊位点间距离的重要方法.目前在计算距离中广泛使用的傅里叶去卷积距离计算方法(Fourier Deconvolution Distance Measurement,FDDM)在某些特殊实验条件下会产生计算误差较大或需要人为设置一些关键参数,从而影响计算结果的客观性等问题.本文在其基础上提出波谱拟合-傅里叶去卷积距离计算方法(Spectrum Simulation-Fourier Deconvolution Distance Measurement,SS-FDDM),比较了SS-FDDM与FDDM方法计算距离的实用性、抗噪能力和磁场偏移修正能力等.结果表明,SS-FDDM方法能一定程度地克服原方法存在的不足,减少由谱偏移和高噪声带来的误差,使计算结果更加准确客观.利用SS-FDDM方法,对不同浓度的自由基冰冻溶液模型样品进行了实际距离计算,验证了该方法是实际可行的.

一种利用荧光蛋白mNeonGreen2鉴定EI24蛋白拓扑结构的方法（英文）

方便且精准地检测跨膜蛋白拓扑结构,尤其是跨膜片段的氨基(N-)和羧基(C-)端的朝向,有利于发现新的蛋白质与蛋白质之间的相互作用,并进一步揭示蛋白质重要的生物学功能.自组装荧光蛋白已被广泛用于观察蛋白质与蛋白质之间的相互作用、标记细胞内源蛋白质并实现mRNA定位的可视化.本文扩展了自组装荧光蛋白的应用,将自组装荧光蛋白mNeonGreen2与定点标记技术相结合,以确定跨膜蛋白的拓扑结构.通过该方法,第一次清楚地证明了EI24的N端和C端均朝向细胞质方向.此外,该方法可用于确定定位于其他细胞器且结构尚未解析的跨膜蛋白的拓扑结构.

生物大分子EPR距离测量方法应用新进展

目的本文从生物大分子功能与结构的密切相关性出发,简述了生物大分子结构中相关位点间距离进行EPR测量及应用的新进展。方法针对电子顺磁共振(EPR)结合定点自旋标记技术(SDSL)测量生物大分子位点间距离的技术特点,着重阐述了EPR在确定蛋白质结构、蛋白质相互作用以及核酸分子上的应用,并对长距离检测的方法和应用进行了展望。结果目前EPR距离测量技术已广泛应用于生物大分子结构和构象变化、相互作用以及运动机制的研究,在许多生物学中的热点和难点问题研究中取得了引人关注的成果。结论 EPR距离测量技术的不断发展将为生物大分子的结构、功能以及动力学研究提供更加准确的研究方法,EPR距离测量技术的深入研究将为其在结构生物学领域的广泛应用开辟更加广阔的空间。

水稻纹枯病防治新药剂的筛选与调查方法评价

试验表明,井冈霉素A·蛇床子素、苯醚甲环唑·丙环唑和己唑醇对水稻纹枯病均具有优良的防治效果,为替换常规药剂井冈霉素水剂提供了药种资源。用病情增长值衡量药剂的防治效果更准确更科学,可用定点标记方法调查水稻纹枯病的病情增长。

用SDSL-EPR技术测量LSECtin-CRD与甘露糖结合过程中的位点运动性变化

目的:应用定点自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术检测肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)的糖基识别结构域CRD上不同位点氨基酸的运动特性及其与甘露糖结合过程中的构象变化。方法:通过SOE-PCR方法对LSECtin-CRD引入半胱氨酸点突变,构建p ET28b-Tat-LSECtin-CRD载体,可溶性表达LSECtin-CRD突变体蛋白;对突变位点进行自旋标记;EPR检测标记后样品的EPR波谱;用SS-FDDM软件对EPR波谱进行模拟和解析,获得旋转相关时间τc,研究其构象特点及变化。结果:在CRD的Ca^(2+)结合位点和配体结合功能区构建了5个突变体蛋白;LSECtin-CRD与Ca^(2+)和甘露糖结合后,4个位点的τc值明显升高,表明CRD结构域整体运动性降低;5个突变位点运动性差异较大,其中A258位点运动性变化最大,可能是参与糖基结合的关键位点。结论:SDSL-EPR技术能够有效研究LSECtin-CRD参与糖基结合过程中的构象运动性,研究结果证明了LSECtin-CRD在与糖基结合后整体运动性受限。

蛋白质中赖氨酸衍生物定点引入的应用研究进展

赖氨酸是蛋白质的翻译后修饰位点以及多种酶活性中心关键残基,与蛋白质的结构与功能密切相关。应用遗传密码扩充技术,由来自于M.barkeri的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(PylRS)和吡咯赖氨酰tRNA(tRNA-Pyl)构成非天然氨基酸定点引入系统,可以实现蛋白质中赖氨酸残基的定点修饰,在蛋白质中定点引入乙酰基等翻译后修饰基团、光反应基团、正交反应基团和光谱活性基团等。目前该系统已在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞中及线虫体内成功地将10种赖氨酸衍生物编码入蛋白质中,为研究蛋白质翻译后修饰、定点标记和定点修饰、蛋白质相互作用提供了有力的工具。综述了应用该系统在蛋白质中定点引入赖氨酸衍生物的应用研究进展,并分析了该系统与目前最常用的系统相比的优势所在。

电子顺磁共振测量蛋白质分子内选定位点之间距离的方法及应用

蛋白质分子的结构决定了其特性和功能,准确测量蛋白质分子中特殊位点之间的距离对其结构解析至关重要。该文在简要介绍电子顺磁共振(electron paramagnetic resonance,EPR)方法测量蛋白质分子内未偶自旋之间距离基本原理的基础上,重点综述了近年来EPR结合定点自旋标记(site-directed spin label,SDSL)技术在研究蛋白质结构与功能方面的应用情况,归纳了EPR-SDSL方法测量距离的特点和存在问题,并提出了改进用连续波EPR技术测量距离的准确度的思路和实现方法。

细菌外膜蛋白BamA突变体构建及位点运动性分析

目的构建细菌外膜β桶状蛋白组装机器(BAM)核心组分BamA点突变原核表达载体,获得特定位点突变BamA蛋白,并分析该蛋白多肽易位相关(POTRA)结构域上G313位点运动特性。方法利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将BamA蛋白第690和700位天然半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S),将POTRA结构域上第313位氨基酸由甘氨酸(G)突为C,构建含BamA-C690S-C700S-G313C突变的原核表达载体pET22b-Strep-BamA。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导突变蛋白表达后,利用Strep-Tactin Sepharose柱亲和层析方法对突变体蛋白进行纯化。甲烷硫代磺酸(MTSL)标记所得纯化蛋白的半胱氨酸后,进行电子顺磁共振(EPR)波谱检测,通过EPR波谱拟合获得旋转相关时间τ_(c),分析G313C氨基酸位点的运动特性。结果构建了BamA-C690S-C700S-G313C突变体原核表达载体,实现了突变体蛋白有效表达和纯化。G313C位点EPR波谱为单成分运动状态波谱,其τc值为(2.30±0.03)ns。结论该研究建立了BamA点突变原核表达和蛋白纯化方法,并获得BamA蛋白G313C运动性特征参数,为进一步研究BamA蛋白在外膜蛋白整合过程中的结构机制提供了数据。