聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体Ⅱ

目的:用聚乙二醇(PEG)修饰集成干扰素突变体Ⅱ(IFN-Con-m2,IIFNm2),通过纯化获得新型修饰分子并对该分子进行抗胰蛋白酶水解稳定性及初步药代动力学研究。方法:将mPEG20000定点偶联到IIFNm2的第86位Cys残基上,修饰后的产物经CM层析后,以SDS-PAGE考察其纯度,用WISH-VSV系统进行生物活性测定;在0.1%胰蛋白酶条件下考察体外抗酶解稳定性;并以SD大鼠进行初步药代动力学研究,绘制血药浓度-时间曲线。采用3P87软件进行数据拟合,分析药物动力学参数。结果:干扰素修饰率约为50%,且绝大多数以单修饰体(mono-PEG-IIFNm2)形式存在;提纯后mono-PEG-IIFNm2的纯度大于98%,比活性约为修饰前IIFNm2的1%。抗胰蛋白酶水解试验表明:30min后,IIFNm2抗病毒活性残留为8%,mono-PEG-IIFNm2为41%。初步药代动力学研究显示:IIFNm的消除半衰期为(1.57±0.34)h,mono-PEG-IIFNm2为(18.0±4.0)h。结论:成功地偶联了PEG和IIFNm2,建立了mono-PEG-IIFNm2的纯化工艺,PEG修饰能增加IIFNm2的体外抗胰蛋白酶水解稳定性,并显著延长体内半衰期。

天花粉蛋白的聚乙二醇定点修饰及其性质的初步研究

用聚乙二醇(PEG)定点修饰天花粉蛋白(TCS),并比较了修饰前后TCS的生物活性、免疫原性及药代动力学等诸多性质.选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点KR173-174进行定点突变,并将所构建的突变体TCSKR173-174CG在大肠杆菌中表达及纯化.通过该突变体第173位引入的半胱氨酸残基进行PEG定点修饰.通过比较研究,分析所构建的PEG修饰型TCS的DNA酶活性、致核糖体失活活性、免疫原性、急性毒性以及药代动力学性质,研究结果表明,所构建的突变型TCS(mTCS)的活性与野生型TCS(wTCS)活性几乎相当,而免疫原性已显著降低.PEG修饰型TCS虽有活性下降,但其免疫原性、急性毒性以及药代动力学性质得到显著提升.表明通过基因工程及化学修饰方法改造TCS是可行的,所构建的突变型及PEG修饰型TCS值得进一步研究.

蛋白药物的聚乙二醇定点修饰策略与最佳位点

聚乙二醇修饰是一种改善蛋白质药物临床药效行之有效的方法。聚乙二醇修饰具有延长蛋白质药物在体内的半衰期、降低免疫原性和延缓蛋白酶降解、提高稳定性和溶解性等优点。而聚乙二醇的定点修饰由于能够获得均一性和高活性保留率的产物,并能提高产率,已经引起了广泛关注。综述了近年来聚乙二醇定点修饰蛋白质药物方面的研究进展,着重介绍了聚乙二醇定点修饰的策略及最佳修饰位点,并对聚乙二醇定点修饰技术的发展趋势进行了展望。

蛋白质多肽药物聚乙二醇定点修饰的研究进展

聚乙二醇修饰可以很好地解决蛋白多肽药物难溶性、稳定性差、半衰期短、毒性大、免疫原性等问题,其中的聚乙二醇定点修饰方式更具优势。本文着重介绍聚乙二醇在蛋白多肽药物中的N端氨基、巯基、羧基和糖类残基及N端氧化后的定点修饰方式的研究进展。

集成干扰素突变体ⅡFN_(72C)的构建及其聚乙二醇定点修饰

目的:设计构建集成干扰素突变体IIFN72C并进行聚乙二醇定点修饰,以获得高活性的长效干扰素分子。方法:利用蛋白质分子同源模建,选择在集成干扰素分子IIFN的第72位引入半胱氨酸残基构成集成干扰素突变体IIFN72C。诱导表达后经包涵体变复性和层析纯化,与单甲氧基聚乙二醇(mPEG-MAL)定点偶联。修饰产物经纯化后,以SDS-PAGE考察其纯度,用WISH-VSV系统进行生物活性测定。结果:IIFN72C以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,比活性与突变前相当;修饰产物大多数为单修饰体,纯化后纯度大于98%,比活性保留约为修饰前的8%。结论:成功设计并表达IIFN72C用于PEG定点修饰,修饰产物活性保留得以提高。

聚乙二醇定点修饰蛋白质药物的技术和临床研究进展

聚乙二醇(PEG)定点修饰蛋白药物是针对蛋白特定基团特定位点的修饰,相比于非定点随机修饰的特点是PEG修饰位点的单一与确定,避免了修饰异构体的干扰,能较好的保留药物体内外活性;修饰产物组成均一、性质稳定,便于质量控制,降低由修饰异构体引起的潜在的安全性风险,并很大程度上提高得率,降低成本。已有PEG定点修饰蛋白药物上市,还有部分处于临床试验阶段。本文综述了PEG定点修饰蛋白药物的技术研究与临床进展,包括PEG定点修饰剂、定点修饰方法、PEG定点修饰的上市和临床药物及面临的问题,并展望了PEG修饰技术未来的发展前景。

胰高血糖素样肽-1衍生物的聚乙二醇定点修饰及其产物性质分析

目的用马来酰亚胺活化的相对分子质量40000的聚乙二醇(MAL-PEG40K)定点修饰胰高血糖素样肽-1衍生物(glucagon like peptide-1analogue,GLP-1a),并分析修饰产物部分性质。方法采用MAL-PEG40K定点修饰GLP-1a,强阳离子交换层析分离纯化修饰混合物,SDS-PAGE及反相高压液相色谱法(RP-HPLC)检测修饰产物MAL-PEG40KGLP-1a纯度,报告基因法检测其体外活性,动物急性降血糖试验检测其体内生物学活性。结果MAL-PEG40K-GLP-1a经SDS-PAGE及RP-HPLC分析,纯度分别为95%和98.1%,体外活性保留率为22.9%,体内具有显著降血糖作用且药效时间明显延长。结论制备的MAL-PEG40K-GLP-1a药学性质获得显著改善,有望开发为安全、长效的新型GLP-1受体激动剂。

聚乙二醇定点修饰蛋白质药物中巯基的研究进展

聚乙二醇(PEG)修饰是解决蛋白质药物溶解度低、稳定性差、半衰期短、具有免疫原性等问题的有效方法,通常在氨基上进行修饰,但在巯基上进行定点修饰更有利于获得结构明确、组成稳定的修饰产物。综述了聚乙二醇定点修饰蛋白质药物中巯基,包括在游离巯基、二硫键和引入的巯基上进行修饰的研究进展。

重组人睫状神经营养因子突变体及其聚乙二醇修饰物的制备及其对ob/ob肥胖小鼠体重、糖脂代谢的影响

目的 制备重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)突变体[rhCNTF(R^6315)]及其聚乙二醇修饰物[P-rhCNTF(R^6315)],探讨两者对ob/ob肥胖小鼠体重及糖脂代谢的影响。方法 采用rhCNTF(R^6315)突变体工程菌株E.coli BL21(DE3)表达rhCNTF(R^6315),经硫酸铵沉淀、Butyl HP和Q HP纯化后采用PEG修饰剂Y-40KD-MAL-mPEG对其C17游离巯基进行定点修饰,经QH P层析纯化获得P-rhCNTF(R^6315)。上述产物进行SDS-PAGE、纯度、修饰率、二级结构表征、修饰位点、体外活性、体内药代动力学检测。将ob/ob小鼠分为P-rhCNTF(R^6315)组(0.05、0.1、0.2 mg/kg)、rhCNTF(R^6315)组及赋形剂组,均采用高脂饲料喂养,同时设C57BL/6J组(普通饲料喂养C57BL/6J小鼠),检测各组小鼠的体重、摄食量及糖脂代谢情况。结果 rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)纯度分别为97.4%和99.3%,平均比活分别为9. 5×10^5和6. 9×10^5 IU/mg,相对比活分别为100%和72.6%;rhCNTF(R6315)修饰率达90%以上,大多数为单修饰产物,PEG修饰未影响rhCNTF(R^6315)的二级结构,修饰位点发生在DLCSR肽段的C17上;P-rh CNTF(R^6315)经皮下及静脉途径给药的血药浓度均在注射后约72 h降至给药前水平。与赋形剂组比较,P-rhCNTF(R^6315)0. 05、0.1、0.2 mg/kg剂量组小鼠在疗程结束时体重组分别减轻了10%、11%和21%(P <0.05),rh CNTF(R^6315)组减轻了30%(P<0.01);治疗后15 d,rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)各剂量组小鼠摄食量明显降低(P<0.05),随后逐渐恢复正常水平;P-rhCNTF(R^6315)各剂量组从给药后8 d起,小鼠随机血糖有所降低,呈一定的量效关系,rhCNTF(R^6315)组从给药后4 d开始有所下降;P-rh CNTF(R^6315) 0.2 mg/kg剂量组和rhCNTF(R^6315)组的口服糖耐量(oral glucose resistant test,OGTT)曲线下面积(AUC0~2 h)及腹腔内脂肪重量显著降低(P<0.05),rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315)各剂量组小鼠皮下脂肪均显著降低(P<0.01)。结论 制备了较高纯度的rhCNTF(R^6315)及P-rhCNTF(R^6315),两者对ob/ob肥胖小鼠的体重过高、高血糖症,体脂重量过高均具有良好的疗效,且P-rhCNTF(R^6315)更长效。