PCR定点诱变方法构建BCR-ABL cDNA竞争性PCR内参照物

本实验通过合成与原有下游引物 (B)相似的一条新引物 (B′) ,经聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增出比原BCR ABLcDNA序列减少了 4个碱基的参照物 ,达到定点诱变的目的。经酶切分析证明 ,两型BCR ABLmRNA均可通过此方法得到相应的cDNA参照物。参照物和待测模板的共扩增产物可通过毛细管电泳达到基线分离 ,证明了其可行性。该参照物可用于慢性粒细胞白血病BCR ABL融合基因的竞争性PCR 。

大肠杆菌热敏毒素LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达的构建

为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性 ,实验依据LT基因的同源序列设计并合成 5条引物 ,采用突出末端PCR法和重组PCR法 ,将克隆于质粒pEWD2 99上的LT基因 ,分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点 ,扩增出带有上述RE位点且含有m7和m112 突变点的约 110 0bp和约 80 0bp的DNA片段和不含突变点的约 30 0bp的DNA片段 ,使控制LT毒力活性中心的第 7位和第 112位氨基酸的碱基分别发生诱变 ,各DNA片段经分离、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后 ,插入经BamHI和Xhol双酶切的线性化的高效表达载体pGEX_4T_1的多克隆位点区 ,使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达 ,将连接产物转化入JM10 5菌株 ,挑出可疑阳性菌落 ,提取质粒 ,经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析 ,证明读框正确 ,序列正确 ,获得了pGEX_4T_1(LTm7和pGEX_4T_1(LTm112 两个重组表达质粒。为运用基因工程手段大量生产人和动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂 ,完成了基因水平的工作。

载脂蛋白M启动子区域T-778C定点诱变与应用

通过改良PCR介导的定点诱变技术,经济且高效地对ApoM基因-778位点进行定点诱变,并运用萤光素酶报告系统检测其启动子活性的变化,探讨ApoM基因-778位点在ApoM基因启动子区域的作用.研究发现ApoM基因-778突变型片段启动子活性下降了两倍左右.ApoM基因T-778C突变体的构建,为进一步研究ApoM基因的功能打下了基础.

重叠延伸PCR定点诱变技术纠正SEA基因中的点突变

目的纠正金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxixsA,SEA)基因中的点突变。方法以携带突变SEA基因的重组载体pLXSN-SEP为模板,采用重叠延伸PCR定点诱变技术,对SEA基因中第133位点碱基点突变(A→G)进行纠正,并构建真核表达载体pcDNA3.1-SEA及测序。结果突变的SEA基因第133位点碱基已由G纠正为A,SEA基因序列与Gene-Bank中公布的序列完全一致。结论重叠延伸PCR定点诱变技术高效、简便,可使SEA基因中突变位点得到纠正;载体pcDNA3.1-SEA的成功构建,为进一步应用SEA基因进行肿瘤基因治疗奠定了基础。

重组水蛭素Ⅲ分子改建及其构效关系的初步研究

采用一种新的PCR定点诱变技术成功地对野生型水蛭素Ⅲ进行了定点诱变 ,这种方法快速、简便 ,有效。通过突变 ,将野生型水蛭素Ⅲ分子的活性功能非必需区的指状结构顶端第 33～36位的氨基酸残基替换为RGDS序列 ,并进行了高效分泌表达 ,表达产物分泌到细胞外发酵液中。改构的水蛭素突变体与野生型水蛭素Ⅲ相比 ,两者的抗凝血酶活性基本一致 ,但体外抗血小板凝集试验结果表明 ,前者除原有的抗凝活性外还具有显著的抗ADP诱导的血小板凝集活性 ,该研究为水蛭素Ⅲ分子的结构功能关系研究以及新型抗凝药物的研制打下了基础。

PLAGL2、TTF-1对SP-C基因启动子的共同调控作用

目的:探讨多形性腺瘤样基因2(PLAGL2)和甲状腺转录因子-1(TTF-1)对表面活性蛋白C(SP-C)基因启动子的共同调控作用。方法:应用定点诱变技术和体外细胞共转染后荧光素酶报告基因活性值检测技术研究PLAGL2、TTF-1对SP-C基因启动子表达活性的影响及相互作用;应用实时荧光PCR技术检测PLAGL2、TTF-1及SP-C在人胚肺和成熟小鼠肺Ⅱ型上皮细胞中的表达。结果:荧光素酶报告基因活性值检测结果显示TTF-1、PLAGL2共转染后所测SP-C基因启动子荧光素酶活性值明显低于PLAGL2共转染后SP-C基因启动子的活性值(P<0.01);SP-C基因启动子野生型质粒转染后的荧光素酶活性值明显低于其突变体质粒转染后的活性值(P<0.005);实时荧光PCR检测结果显示,PLAGL2基因的表达水平随胚肺发育成熟而逐渐减少,TTF-1和SP-C基因的表达水平则逐渐增高。结论:在肺Ⅱ型细胞中,PLAGL2和TTF-1对SP-C基因共同调控的过程中体现出一种动态平衡、相互抑制的关系。

TTF-1相关蛋白26磷酸化位点突变体的构建

目的制备TTF-1相关蛋白26（TAP26）的3个磷酸化位点（S48，S66和T219）的突变体（TAP26（S48→A48）、TAP26（S66→A66）和TAP26（T219→V219））。方法采用定点诱变PCR技术，分别突变掉TAP26的3个磷酸化位点（S48，S66和T219），并获得TAP26的3个相应突变体。结果DNA序列分析结果显示TAP26的3个突变体序列正确。结论通过定点诱变PCR技术，成功构建了TAP26的3个突变体。

TAP26磷酸化对SP-C基因表达调控影响的研究

目的:探讨TTF-1相关蛋白26(TAP26)磷酸化位点对SP-C基因表达调控的影响。方法:采用定点诱变PCR技术产生TAP26的4个磷酸化位点突变体TAP26(S48→A48)、TAP26(S66→A66)、TAP26(T167S168→V167A168)、TAP26(T219→V219);通过体外细胞共转染后荧光素酶报告基因活性值检测技术研究野生型TAP26及其4个突变体质粒对SP-C基因启动子表达活性的影响。结果:荧光素酶报告基因活性值检测结果显示,分别与共转染野生型TAP26和其它3个突变体质粒相比较,共转染TAP26(S66→A66)突变体质粒的荧光素酶活性值最低,经统计分析差异均有统计学意义(P<0.05,n=9)。结论:TAP26磷酸化对促进SP-C基因表达具有非常重要的作用,TAP-26的S66位点则是与TTF-1相互作用从而共同调控SP-C基因表达的一个关键PKC磷酸化位点。

PLAGL2对SP-C基因表达调控的作用靶点研究

目的研究PLAGL2对SP-C基因表达调控的作用靶点。方法定点诱变技术分别突变掉SP-C基因启动子上PLAGL2的结合位点以及PLAGL2的第6、7位锌指结构域序列并获得相应的突变体;凝胶电泳迁移实验研究PLAGL2及其突变体分别与SP-C基因启动子及其突变体之间的相互结合作用。结果PLAGL2能与同位素标记的SP-C基因启动子片段相结合形成蛋白-DNA复合物,而两者的突变体却不能与相应的蛋白或DNA片段发生相互作用。结论PLAGL2通过其第6?7位锌指结构与SP-C基因启动子上PLAGL2的核心和簇结合位点序列相互结合从而实现对SP-C基因的表达调控。

xyl-d二型乙醇脱氢酶(SADH)G198R突变体的研究

本研究通过设计简并引物及文献参考,PCR克隆得到嗜热厌氧菌菌株xyl-d的SADH,并利用定点诱变技术将该酶的198位苷氨酸(Gly)突变为精氨酸(Arg).将野生型和突变基因连接到原核表达载体pET28a,IPTG诱导表达,再经镍柱纯化,然后比较了两个蛋白分别以NAD/NADH,NADP/NADPH为辅因子、异丙醇或异丁醛为底物、55℃条件下的酶活.发现突变后蛋白的总体催化活性相对于野生型有所下降,其中突变蛋白对NAD/NADH的亲和性分别下降了约8倍和6倍,而且对NADPH的亲和性下降也非常明显,但对NADP的亲和性变化却不大.

烟碱型乙酰胆碱受体α3[K152E,E184D,Q195T]β4突变型的构建及其功能研究

α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是成瘾、癌症和肥胖等重要疾病的潜在新靶点。本研究对大鼠(rat,r)α3β4 nAChRs的α3亚基上的3个氨基酸位点同时进行突变,将这3个位点分别突变为rα6亚基上与α3亚基上相对应的氨基酸种类,构建α3[K152E,E184D,Q195T]β4三点突变型受体,并研究其功能。利用PCR介导的定点突变方法构建了α3[K152E,E184D,Q195T]三点突变体载体,体外转录获得相应的cRNA,与野生型β4亚基的cRNA按相同比例注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行重组表达,然后用双电极电压钳技术检测其受体活性和功能。测定α3β4 nAChRs野生型和突变型在乙酰胆碱、尼古丁和金雀花碱3种不同激动剂的诱导下,其配体门控电流的大小以及门控特征,比较野生型和突变型受体之间的功能差异。α3[K152E,E184D,Q195T]三点突变体的功能与野生型相比存在显著差异。乙酰胆碱、尼古丁和金雀花碱对α3β4 nAChR野生型的半数最大效应浓度(EC_(50))分别为277.5、34.02和23.05μmol·L^(-1);针对三点突变体,3种激动剂的EC_(50)分别为170.5、26.6和98.45μmol·L^(-1)。3种激动剂对突变体的EC_(50)与野生型受体的EC_(50)相比,其活性变化分别为0.6、0.8和4.3倍。其中突变型受体对金雀花碱的活性影响最显著,其激动剂活性下降了77%。此外,与1 mmol·L^(-1)乙酰胆碱诱导的峰值电流幅度相比,金雀花碱对野生型和突变型α3β4 nAChRs的最大激动效率(E_(max))从94.12%提升至155.08%。α3[K152E,E184D,Q195T]β4三点突变型明显降低了对金雀花碱的敏感性,但其最大激动电流幅度明显变大。三点突变型略微增强了对乙酰胆碱和尼古丁的敏感性,说明α3亚基上的这3个氨基酸对α3β4 nAChRs的配体结合功能影响较大,对不同激动剂的影响情况各异,这为今后探究α3β4 nAChRs重要受体的精细结构和功能以及相关疾病的发病机制研究提供了很好的线索。