双手性金属协同催化立体发散性合成非天然α-氨基酸

手性非天然α-氨基酸广泛存在于天然产物和生物活性分子中,一直以来都是有机化学的研究热点.另外,烯烃合成过程中碳-碳双键的Z和E构型的精确控制是合成化学中的一个重要挑战.文中介绍了张万斌和麻生明团队近期在非天然α-氨基酸不对称合成领域中的一个亮点工作,通过双手性金属协同催化策略,实现了具有三取代烯烃结构的非天然α-氨基酸的立体发散性合成,反应收率高,对映选择性和Z/E选择性好,为药物设计和蛋白质修饰提供了更多的选择.

基于非天然氨基酸的蛋白质合成研究进展

蛋白质是生命体的重要组成部分,几乎参与了所有的生命活动。通常情况下生物体中蛋白质由20种天然氨基酸组成,但随着现代科技的飞速发展,人们对医疗、食品、材料等方面的需求日渐增大,这些蛋白质已经无法满足多样化的应用需求。随着非天然氨基酸及其合成的蛋白质的优异性能,使得利用非天然氨基酸改造蛋白质的技术逐渐成为研究热点。非天然氨基酸有着不同于天然氨基酸的侧链基团,可以给蛋白质带来新的性质与功能。该文基于对非天然氨基酸及非天然蛋白质的研究,首先介绍了以化学及生物的手段合成非天然氨基酸的方法,同时对化学及生物法的优劣势及未来的发展前景进行了总结;然后介绍了将非天然氨基酸掺入蛋白质的几种热门方法;接着对非天然氨基酸及其合成蛋白质的应用在酶的改造、科研以及医疗方面进行了列举和描述;最后对这项技术未来的发展进行了展望与总结。

非天然氨基酸的应用及生物合成策略

非天然氨基酸是一类不受遗传密码子约束的特殊氨基酸,它们具有独特的空间构型和化学性质,为多个领域提供了新的资源和机会。当前,非天然氨基酸可以通过化学合成和生物合成两种方式合成,其中相较于化学合成,生物合成具有更高的效率和立体选择性、更低的成本和污染,是一种有潜力的合成方式。本文综述了非天然氨基酸在蛋白质探针、酶工程、抗体药物偶联物、抗菌肽等方面的研究进展和应用案例,展示了非天然氨基酸如何突破天然氨基酸的限制,拓展蛋白质的结构和功能多样性。同时介绍了非天然氨基酸的生物合成策略,包括代谢工程中的静态调控和动态调控策略以及发酵优化策略。最后,展望了非天然氨基酸的生物合成和应用的未来发展趋势和挑战,为非天然氨基酸的合成和开发提供参考和启示。

美研究者利用工程菌合成非天然氨基酸

2023年5月15日,Nature Chemical Biology报道,美国特拉华大学(University of Delaware)研究团队通过工程改造大肠杆菌,成功合成了一种先前被证实具有调控机体免疫功能的非天然氨基酸——对硝基-L-苯丙氨酸(pN-Phe)。研究者用单一细菌菌株来制造这些氨基酸,并将之放在目标蛋白质的特定位点。这一研究结果为将来开发独特的疫苗及免疫治疗方法提供了研究基础。

非天然氨基酸定点偶联抗人类表皮生长因子受体2-抗体偶联药物的药理学活性

目的:考察用非天然氨基酸定点偶联技术获得的均一性良好的抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)-抗体偶联药物(antibody drug conjugate,ADC),对9种不同HER2表达量的肿瘤细胞的增殖抑制活性,以及对5种异体移植的肿瘤小鼠模型的肿瘤生长抑制效果。方法:用QIFI试剂盒通过流式细胞仪检测HER2在BT-474、Calu-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3、SK-OV-3、HCC1954、NCI-N87共9种肿瘤细胞中的表达。对9种肿瘤细胞进行培养,铺板过夜后分别加入梯度稀释的抗HER2-ADC、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、AS269、pAF-AS269、紫杉醇5种药物,然后培养72 h或96 h,检测这5种药物对肿瘤细胞的增殖抑制活性。选择HER2阳性肿瘤细胞HCC1954、BT-474、SK-OV-3、NCI-N87和HER2阴性肿瘤细胞MDA-MB-468,分别接种到5~6周龄的BALB/c裸小鼠身上,待肿瘤长到一定体积后,分别注射抗HER2-ADC、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、曲妥珠单抗、紫杉醇4种药物和空白对照磷酸盐缓冲液,考察药物的抑瘤效果。结果:流式细胞仪检测结果显示,SK-OV-3、NCI-N87、SK-BR-3、Calu-3、HCC1954、BT-474这6株肿瘤细胞的HER2表达量较高,每个细胞表面HER2受体数在43~80万个,比另外3株MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-468肿瘤细胞的HER2表达水平高50倍以上。药物对9种肿瘤细胞的增殖抑制活性结果显示,抗HER2-ADC对HER2高表达的细胞有很强的抑制细胞生长活性,对SK-OV-3、NCI-N87、SK-BR-3、Calu-3、HCC1954、BT-474的半数抑制浓度分别为46、17、17、161、125、50 pmol/L。在动物体内药效试验中,抗HER2-ADC在所有HER2阳性表达的肿瘤模型中都表现了较强的呈剂量依赖的抗肿瘤活性,在NCI-N87异种移植肿瘤模型中,与曲妥珠单抗及曲妥珠单抗-美坦新偶联物相比,相同剂量的抗HER2-ADC表现出更好的抗肿瘤活性,其相对肿瘤增殖率约为二者的1/30至1/20,在HCC1954模型中表现出肿瘤的完全消退和治愈效果;抗HER2-ADC对HER2低表达MDA-MB-468肿瘤细胞移植瘤模型没有效果。与曲妥珠单抗-美坦新偶联物相比,抗HER2-ADC表现出相同或更好的抗肿瘤活性。结论:用非天然氨基酸定点偶联技术获得的抗HER2-ADC在细胞体外和动物体内实验中对HER2高表达的肿瘤具有明显的抑制效果。

含有络合功能基的非天然氨基酸的设计、合成及在生物活性肽中的应用

设计合成了一类侧链带有络合基团的非天然氨基酸,即侧链带有N,N-二羧甲基氨甲基、N,N-二酰胺甲基氨甲基和N,N-二羟乙基氨甲基的苯丙氨酸衍生物,并将这类非天然氨基酸用于促性腺激素释放激素(LHRH)类似物的固相合成.高效液相色谱分析结果表明,粗肽的纯度较好,易于纯化;用电喷雾质谱测定了多肽的分子量.这些非天然氨基酸可作为其它肽类药物合成的构建单元.

含非天然氨基酸定点突变的MLL3_(SET)蛋白表达与纯化

在组蛋白H3K4甲基转移酶MLL3的催化结构域(MLL3_(SET))中定点引入非天然氨基酸N-炔丙基赖氨酸(N-propargyl-lysine,PrK),表达、纯化该突变蛋白(MLL3_(SET)*),并评估突变蛋白的酶活,为后续进一步利用单分子荧光共振能量转移技术(smFRET)表征MLL3的作用机制奠定基础。将MLL3_(SET)接入pET-28b(+)构建表达载体,通过MLL3_(SET)晶体结构分析选择N4905位点进行PrK的引入;对商业化菌株(C321.ΔA.exp)进行基因组改造以引入T7 RNA聚合酶基因,并在改造后的菌株中表达、纯化MLL3_(SET)^(*),最后测定MLL3_(SET)^(*)的酶活性。结果表明,在构建的C321.ΔA.exp lacZ∷T7p07菌株中,pET28b-MLL3_(SET)^(*)在共转入aaRS-tRNA正交系统以及外源添加PrK后能够正常表达;通过Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析成功纯化出高纯度的MLL3_(SET)^(*)蛋白;多酶级联反应结果显示,MLL3_(SET)^(*)的酶活性比野生型蛋白低,但仍具有约43%的甲基转移酶活性。本研究成功实现了含PrK的MLL3_(SET)蛋白的原核表达与纯化,突变蛋白保留了一定酶活性,为后续深入研究MLL3的分子机制奠定了基础。

一类含噻唑环非天然氨基酸的合成及其拆分

用乙酰基转移酶拆分3－（今噻唑基）－DL-乙酰丙氨酸可直接得到供合成多肽药物使用的L-型氨基酸．该方法合成路线短，分离效果好（e．e．值在99％以上）.类似地合成并拆分了3－（2－R－4噻唑基）-丙氨酸（R=CH3，Ph），获得同样好的效果．

两亲性结构修饰的非天然氨基酸及二肽的合成

目的合成两亲性结构修饰的非天然氨基酸和二肽。方法将具有两亲性结构特点的甜菜碱的羧基活化成酰氯,然后与对氨基苯丙氨酸的侧链氨基反应,制备甜菜碱修饰的非天然氨基酸构建单元和目标二肽,并进行油水分配系数的测定。结果得到了1个甜菜碱修饰的非天然氨基酸和2个甜菜碱修饰的二肽。结论甜菜碱修饰的二肽具有更强的两亲性,为增强药物两亲性,改善药学性质提供了一种新的选择。

非天然氨基酸pBpa在IL1β抗原表位的嵌入及其表征

为了探究表位中嵌入光敏型非天然氨基酸的蛋白质与其特异性抗体的光交联反应及其产物,基于基因密码子扩展技术,原核表达嵌入携带功能基团的非天然氨基酸蛋白质IL1β-L67pBpa,通过Western blot方法验证该突变体蛋白及其抗体的光交联功能.结果表明,本研究成功构建了pET28a-IL1β-L67TAG突变体质粒用于原核表达,在蛋白质的指定位点嵌入非天然氨基酸pBpa,并得到了高效表达的IL1β-L67pBpa.365 nm紫外光照射后,该突变体中的非天然氨基酸pBpa光敏基团与抗体中的氨基酸在空间距离靠近时,pBpa嵌合体能与其表位抗体(康纳单克隆抗体)通过共价键的光交联形成新的复合物.本研究证实了将非天然氨基酸(活性基团)插入到蛋白质特定位点的可行性.

利用非天然氨基酸代谢掺入法检测新生成蛋白

以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激Raw264.7细胞产生肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)为模型体系,建立了非天然氨基酸代谢掺入法检测特定新生成蛋白的方法。通过代谢掺入的方法,使细胞中的蛋白质,特别是新生成的蛋白质一级结构中掺入非天然氨基酸,即带有叠氮基团的甲硫氨酸类似物(Azidohomoalanine,AHA)。考察了在不同浓度的LPS和FBS,以及不同的刺激时间等条件下,LPS刺激Raw264.7细胞产生TNF-α的实验参数,确定了最优的实验条件为:在含有1%胎牛血清的无甲硫氨酸(Met)的DMEM培养基中,分别在不加LPS和加10 ng/m L的LPS条件下刺激Raw264.7细胞4 h,在刺激细胞的同时掺入AHA。利用Cu+催化的叠氮基团与带有生物素(Biotin)标签的炔烃基团的环加成反应,使蛋白质标记上Biotin标签。利用吸附在固相载体上的抗体特异性捕获TNF-α分子,再用耦联辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)的链霉亲和素(Streptavidin)对TNF-α分子上的Biotin进行识别,实现对特定的新生成蛋白质(TNF-α)进行检测。本方法为检测特定微量新生成蛋白、表征特定蛋白质的周转等研究提供了新的思路法。

非天然氨基酸修饰蛋白质研究进展

蛋白质修饰是改善其物理化学和生物学特性的一种重要方法,目前已成为生物技术、生物催化和生物医学领域的研究热点.非天然氨基酸在蛋白质修饰中表现突出.介绍了非天然氨基酸种类及修饰方法,概述了其应用领域,以期为扩大利用此方法者提供参考.

高效液相色谱法测定非天然氨基酸的光学纯度

以(1氟2,4二硝基苯基)5L缬氨酰胺为手性试剂、反相高效液相色谱法测定非天然氨基酸的光学纯度。梯度洗脱,流动相A:含体积分数为0.1%的三氟乙酸的乙腈,流动相B:体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液。L和D对映体得到良好分离。准确测定了25种非天然氨基酸L和D对映体的光学纯度。

应用Arndt-Eistert反应合成手性非天然N-Fmoc-β-氨基酸(III)

以重氮甲烷为重氮化试剂 ,以非天然N Fmoc α 氨基酸为原料 ,成功地运用Arndt Eistert反应 ,通过两步反应 ,高效快捷地合成了 8个对应的同系物N Fmoc β

ω-转氨酶不对称合成手性胺及非天然氨基酸的研究进展

ω-转氨酶不对称合成手性胺及非天然氨基酸是目前生物加工过程的研究热点之一。ω-转氨酶具有优良的立体选择性及区域选择性,利用其进行生物催化生产手性胺,已被应用于医药、农药和化工等领域。本文中,笔者综述了ω-转氨酶的基本结构特性,并以转氨酶法制备西他列汀关键中间体等为例,同时阐述了该酶的高通量筛选方法及分子改造方面的研究进展,并对级联反应提高手性胺产量的策略作了进一步讨论。最后,本文简要总结了ω-转氨酶在不对称合成非天然氨基酸中的具体应用。

基因编码非天然氨基酸技术及其在生物医学领域的应用

人体内蛋白质通常由20种天然氨基酸组成。氨基酸的不同排列组合及立体构象是构建丰富多样性的蛋白质的基础。近年来开发的突破性基因密码子拓展技术通过向目标蛋白质中定向引入非天然氨基酸,能够赋予原有的靶蛋白以共价结合邻近蛋白质、携带荧光基团、模拟蛋白质的翻译后修饰等新的生物学特性。本文从非天然氨基酸的结构和功能出发,介绍了不同类型的非天然氨基酸分别在调节蛋白质稳定性、研究蛋白质构象、表达水平、定位以及识别和增强蛋白质间亲和作用等方面的用途。此外,基因编码非天然氨基酸技术在生物医学领域的应用前景,将为生物药物的设计及优化提供全新的思路和方法。

固定化酶催化剂在合成非天然氨基酸中的应用

非天然氨基酸是重要的精细化工原料和医药中间体。采用酶催化制备非天然氨基酸,具有绿色、安全、收率高、成本低等优点。通过固定化这一技术手段,酶可以回收使用达20次以上。

天然非蛋白氨基酸的生物活性机制研究进展

非蛋白氨基酸是食品药品中一类重要的天然活性物质,其来源丰富、种类繁多、作用机制复杂。本文参考国内外相关文献,总结了一些迄今为止对人类影响较大且研究较为深入的天然非蛋白氨基酸,对其生物来源、已知生物活性和作用机制进行了综述,旨在探讨这类天然化合物在农业、环境、食品、医药以及生命科学等领域的潜在应用价值。

E.coli酪氨酸转氨酶的纯化与非天然氨基酸的底物特异性检测

构建重组菌株E.coliBL21(DE3)转pET23a-tyrB,IPTG诱导其大量表达,然后依次通过盐析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析获得纯酶,运用薄层层析技术(TLC)检测,结果表明纯化的TyrAT转氨酶对自身底物酪氨酸在37℃和50℃具有较高活性.分别加入非天然氨基酸L-正缬氨酸、L-新戊基甘氨酸、L-叔亮氨酸、D-正亮氨酸作为底物,检测到TyrAT转氨酶对L-叔亮氨酸在50℃下有活性,对D-正亮氨酸在37℃和50℃均有催化活性,且50℃下效果更好.

非天然磷酰化氨基酸对胰蛋白酶的荧光猝灭效应

作者利用荧光法研究了非天然L-型氨基酸磷酰化前后与胰蛋白酶的相互作用。实验结果表明,L-2-氨基戊酸、庚酸、辛酸及壬酸非天然氨基酸不能使胰蛋白酶的荧光强度减弱,非天然氨基酸磷酰化后能够对胰蛋白酶产生荧光猝灭。同时,浓度不同、侧链长度不同的同系列磷酰化氨基酸对胰蛋白酶的猝灭效应均不同。随着非天然脂肪酸链磷酰化氨基酸侧链的增长及磷酰化庚酸浓度的增大,胰蛋白酶的荧光强度均明显降低,并且其荧光可以被完全猝灭。非天然氨基酸的磷酰化能够影响非天然氨基酸与胰蛋白酶的相互作用。