应用甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值

目的 :评价由甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因甲基化对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值。方法 :运用甲基化特异性聚合酶链反应 ,分析了 38例各种类型的急性白血病在初诊时和缓解后的不同阶段P15基因的甲基化状态。结果 :①甲基化特异性聚合酶链反应检测P15基因甲基化的敏感性为 2 .0× 10 -4。② 38例急性白血病初诊时的P15基因甲基化的出现率为 6 8.4 % ,正常对照组无甲基化。③P15基因甲基化可能与疾病的预后有关。经治疗后P15基因甲基化消失的病人与P15基因甲基化持续存在的病人复发率之间的差异有显著性 (0 %比 6 8.8% ,P <0 .0 1)。结论 :P15基因甲基化状态在急性白血病中有较高的检出率 (达 6 8.4 % )。应用甲基化特异性聚合酶链反应分析急性白血病P15基因甲基化状态的特异性和敏感性高。该指标可监测急性白血病微小残留病灶相关的情况 ,值得在临床上推广。

甲醛固定石蜡包埋切片经特殊染色后荧光定量聚合酶链反应检测的再利用

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的特异性炎症,在甲醛固定石蜡包埋组织切片中查见MTB是确诊结核的“金标准”。目前,结核病诊断的主要辅助检测方法是特殊染色和qRT-PCR检测。在临床病理诊断中,部分结核病患者由于获取标本困难,穿刺标本微小,病理组织多被用于HE染色、特殊染色,所剩组织太少无法进行相关分子检测。

荧光定量聚合酶链反应技术检测痰结核分枝杆菌DNA及其临床应用研究

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术在肺结核诊断中的临床价值。方法对144例活动性肺结核的痰及30例健康对照者的痰进行 FQ-PCR 检测,并与痰涂片检查法、改良罗氏培养法结果进行比较。结果 FQ-PCR 检测痰结核分枝杆菌阳性率、痰涂片抗酸检查法阳性率、改良罗氏培养法阳性率分别为61.1%(88/144)、51.4%(74/144)、55.6%(80/144),以 FQ-PCR 检测痰结核分枝杆菌阳性率为最高,FQ-PCR 检测特异性为100%。结论 FQ-PCR 技术检测痰结核分枝杆菌具有较高的敏感性和特异性,该方法快速、准确,对肺结核的诊断有一定价值。

定量聚合酶链反应检测327例肝病患者血清HBV DNA及其临床意义

乙型肝炎的诊断既往主要依赖于血清学指标(乙肝3对)和HBV DNA斑点检测。随着聚合酶链反应(PCR)日趋成熟,HBV DNA目前被认为是检测乙型肝炎病毒的最敏感、最直接的指标。定量PCR使PCR技术更趋于敏感稳定,国外已有此方面报道。我们应用定量PCR技术检测各种肝炎及肝癌患者血清HBV DNA含量。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

巢式甲基化特异性PCR检测肺癌病人WIF-1基因启动子区异常甲基化

为了检测肺癌患者血浆中WIF-1基因启动子区的甲基化状态,收集肺癌患者及健康对照者的血浆标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测WIF-1基因启动子区甲基化状态,并与普通甲基化特异性PCR(MSP)法进行了比较,结果在58例肺癌患者血浆样品中经nMSP法发现20例WIF-1基因启动子的过甲基化,用MSP法只检出10例,有吸烟史组WIF-1基因的甲基化率高于无吸烟史组(P<0.05).而20例正常对照血浆中都未检测到WIF-1基因启动子的过甲基化;表明利用巢式MSP(nMSP)法检测外周血血浆中WIF-1基因启动子的甲基化,可为非损伤性筛选和早期诊断肺癌提供有价值的信息.

巢式甲基化特异性PCR检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化

为了检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子的甲基化状态,收集肝细胞癌患者及健康对照者的血清标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化状态.结果肝细胞癌患者血清样品中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化率为53.12%和31.25%,68.75%的患者血清可以检测到异常甲基化,正常对照血清中未检测到RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化,RASSF1A和CDH13基因甲基化与患者的临床病理资料无明显相关性(P>0.05);表明nMSP法检测血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化具有较高的敏感性,可为肝细胞癌的筛查、早期诊断和预后判断提供有价值的信息.

甲基化特异性PCR检测肺癌p16基因甲基化及其临床意义

目的:探讨甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specificPCR,MSPCR)在肺癌临床诊断中的应用价值。方法:选取56例肺部疾病住院患者手术切除的病变肺组织和相应的支气管肺泡灌洗液(BALF)及痰标本,其中32例为肺癌,24例为良性肺部疾病。标本经一般处理,PCR扩增后,产物经电泳EB染色,紫外灯下观察。结果:32例肺癌组织标本中,14例(43.8%)在p16基因启动子区域呈现异常甲基化,其中9例(64.3%)在相应的BALF中检测出甲基化存在,5例(35.8%)在相应的痰标本中也检测出甲基化存在。24例良性肺部疾病,其中肺囊肿10例,肺结核14例,手术切除标本和BALF及痰标本中均未检测出p16基因甲基化存在。结论:MSPCR技术对肺癌患者BALF及痰标本中的异常甲基化检测具有高度特异性,是一项有潜力的肺癌早期诊断新技术。

聚合酶链反应在前列腺癌诊断中的应用

着重介绍反转录PCR(RT -PCR)检测前列腺肿瘤标志物如前列腺特异抗原 (PSA)和α -甲酰基辅酶A消旋酶 (AMARC)诊断前列腺癌的意义及进一步研究的方向。还介绍了利用甲基化特异性PCR技术检测π类谷胱苷肽 -S -转移酶I(GSTP1)CpP岛甲基化程度在诊断前列腺癌中的意义。

子宫内膜癌中DKK-1基因启动子低甲基化改变与其临床病理特征的关系

目的探索Dickkopf相关蛋白1(DKK-1)基因启动子区甲基化变化与子宫内膜癌临床病理特征的关系。方法采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)对52例子宫内膜癌、30例子宫内膜不典型增生患者及25例正常子宫内膜受试者进行DNA甲基化状态检测。免疫组织化学[链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(immunohistochemistry,streptomyces antibiotin protein-peroxidase binding,IHC S-P)]法测定雌激素受体、孕激素受体在子宫内膜癌细胞中的表达。结果检测到38例(73.08%)子宫内膜癌组织中DKK-1基因启动子区发生低甲基化改变,而子宫内膜非典型增生组织中为14例(46.67%)及正常子宫内膜组织为9例(36.00%)(χ^(2)=11.289,P=0.030)。DKK-1低甲基化阳性率在子宫内膜癌患者的不同国际妇产科联盟(FIGO)分期、病理类型和分级、雌、孕激素受体表达中差异具有统计学意义(P=0.043)。结论DKK-1基因启动子区低甲基化可能是子宫内膜癌发生中的早期且频发事件,且可能与子宫内膜癌的侵袭、迁移和不良预后密切相关。

甲基化特异性PCR检测胃癌p16基因甲基化及其临床意义

目的初步探讨甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR)在胃癌临床诊断中的应用价值。方法选取47例胃癌患者的癌组织及配对的癌旁组织,11例远离肿瘤的正常胃黏膜组织。标本经一般处理,PCR扩增后,产物经电泳EB染色,紫外灯下观察。结果47例胃癌组织标本中,22例(46.2%)在p16基因的启动子区域呈现异常甲基化;47例癌旁组织标本中,28例(58.6%)也检测出甲基化存在;11例正常胃黏膜组织标本中均未检测出p16基因甲基化存在。结论MSPCR技术对胃癌患者组织标本中的异常甲基化检测具有高度特异性,是一项具有潜力的胃癌早期诊断新技术。

巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的 介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法 将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果 在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论 筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。

谷胱甘肽过氧化物酶3甲基化及蛋白表达在胃癌中的临床意义

目的探讨血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)3基因启动子甲基化及GPX3蛋白表达在胃癌发病中的临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测胃癌组和胃炎组血标本中的GPX3甲基化程度;采用免疫组化方法检测胃癌组和癌旁正常组织标本中的GPX3蛋白表达情况,分析其与临床病理特征间的关系。结果 1胃癌组GPX3甲基化程度显著高于胃炎组(P<0.01);胃癌伴有淋巴结转移组GPX3甲基化程度显著高于无淋巴结转移组(P<0.05);胃癌组GPX3甲基化程度与患者年龄、性别和肿瘤分化程度、浸润情况、TNM分期无关(P>0.05);2胃癌组GPX3蛋白表达较癌旁正常组显著降低(P<0.01);胃癌伴有淋巴结转移组GPX3蛋白表达显著低于无淋巴结转移组(P<0.05);胃癌组GPX3蛋白表达与患者年龄、性别和肿瘤分化程度、浸润情况、TNM分期无关(P>0.05);3胃炎组GPX3蛋白表达与癌旁正常组无显著差异(P>0.05)。结论GPX3基因启动子区高甲基化通过下调GPX3蛋白表达,参与胃癌发生和促进淋巴结转移,有潜力成为诊断胃癌、判断预后的预警分子指标和临床治疗中的基因调控靶点。

实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法。方法以肺癌细胞株NCI-H460作为RASSF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆。用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA。对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测。以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量。结果实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆)。15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%)。5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml。结论实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强。

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用

目的 改进甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态。方法 用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后 ,采用半巢式MSP(引物分别为MS ,M1A和MS ,M2A) ,分析了 6 0例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态。结果 单独用MSP ,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为 80 %。采用半巢式MSP ,甲基化发生率为86 7% ,比单独采用MSP提高了几个百分点 ,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式。结论 半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性。同时 ,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关。

卵巢癌HOXA10基因启动子区低甲基化改变与其临床病理特征的关系

目的:探讨HOXA10基因启动子区甲基化与卵巢上皮性癌(卵巢癌)的关系。方法:运用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测29例卵巢癌标本及对照组16例正常卵巢组织中HOXA10基因启动子甲基化状态,并分析HOXA10基因甲基化状态与不同临床病理特征的联系。结果:检测到17例(58.62%)卵巢癌组织HOXA10基因启动子区发生低甲基化改变,另外4例甚至为完全去甲基化改变;而仅有4例(25.00%)正常卵巢组织HOXA10基因启动子区发生低甲基化(P<0.05)。HOXA10低甲基化阳性率随淋巴转移而增高(P<0.05)。不同年龄、瘤体大小、WHO病理分级、FIGO临床分期和HOXA10基因低甲基化未见明显相关性(P>0.05)。结论:HOXA10基因启动子区低甲基化为频发事件,提示与卵巢癌患者的不良预后相关,可作为卵巢癌判断预后的生物学标志物。

N6-甲基腺苷甲基化相关因子在小鼠骨骼肌损伤修复中的表达及机制

目的探讨N6-甲基腺苷(m6A)甲基化相关因子在骨骼肌损伤后修复过程中的时间动态表达及其对损伤过程中巨噬细胞炎症反应的调控作用。方法建立BaCl2损伤小鼠腓肠肌模型,对照组和损伤组每组4只小鼠。分别于小鼠损伤后第1、3、5、7、9天取腓肠肌组织进行实验;分离培养原代腓肠肌肌组织细胞,肌卫星细胞,肌细胞和培养成肌细胞系C2C12细胞,添加地塞米松(DEX,50μmol/L)处理细胞模拟损伤;脂多糖(LPS,100μg/L)处理巨噬细胞系RAW264.7细胞模拟骨骼肌损伤后的炎症反应,LPS处理前添加STM2457(30μmol/L)抑制m6A甲基转移酶3(Mettl3)的作用。利用Real-time PCR和Western blotting方法检测m6A甲基化相关因子(Writers,Erasers,Readers)的表达和炎症因子的表达。结果肌纤维随着损伤时间的延长,出现溶解后逐渐修复,单核/巨噬细胞数量先增加后减少,配对盒7(Pax7)mRNA水平随着损伤时间的变化先升高后降低。与对照组相比,腓肠肌中的m6A甲基化相关因子的mRNA水平和蛋白水平在损伤第1天时变化不显著,到损伤第3天显著升高(P<0.05);损伤后第5天与第3天相比显著下降(P<0.05);损伤后第7天和第9天与对照组相比差异无显著性。DEX降低了原代肌卫星细胞和C2C12细胞m6A甲基转移酶因子的mRNA表达水平(P<0.05),升高了甲基化识别酶因子的mRNA表达水平(P<0.05)。骨骼肌肌组织细胞和肌细胞中m6A甲基化相关因子的mRNA水平在DEX处理后均显著升高(P<0.05)。LPS导致巨噬细胞中m6A甲基化相关因子的mRNA和蛋白水平及炎症因子白细胞介素(IL)-6和IL-1β的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),而抑制Mettl3之后,巨噬细胞炎症因子mRNA水平显著下降(P<0.05)。结论m6A甲基化相关因子在受损的肌细胞和巨噬细胞炎症反应中被激活,抑制m6A甲基转移酶能够减弱巨噬细胞炎症反应。

荧光定量逆转录聚合酶链反应在前列腺特异性抗原基因检测中的应用价值

目的 利用Taqman技术 ,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应 (FQ RT PCR)技术 ,对前列腺癌病人外周血中前列腺特异性抗原基因 (PSAmRNA)进行定量检测。方法 在PSA基因的外显子 2和 3之间设计一对引物和一条Taqman探针 ;优化反应体系的条件 ,以不同LNCaP细胞含量为标准品和其循环阈值 (Ct值 )制作标准曲线 ,检测外周血中PSAmRNA含量 ;对本方法进行方法学评价及初步临床应用评价。结果 成功建立了FQ RT PCR检测PSAmRNA技术 ,本方法最低检测限为每毫升全血 5个LNCap细胞 ,线性范围为 5～ 1 0 8细胞 /ml,批内和批间变异系数分别为 9 5 %～1 4 3%和 1 5 2 %～ 2 0 1 % ,扩增产物克隆和测序分析显示本扩增片段为PSAmRNA序列的特异性片段。初步临床研究显示 ,1 0例经ECT ,检查证实骨转移的前列腺癌患者的外周血均检到PSAmRNA ,其含量变化为 8～ 1 0 4细胞 /ml,健康男性、女性各 5名外周血中PSAmRNA含量均小于本法最低检测限。结论 荧光定量逆转录聚合酶链反应检测PSAmRNA具有灵敏、特异、简便、结果数据化等特点 ,该方法可为前列腺癌微转移诊断、预后判断、指导治疗等奠定良好基础 。

改变退火温度对甲基特异性PCR检验指标有效性的影响

目的探讨政变退火温度对甲基特异性聚合酶链反应PCR检验指标有效性的影响。方法将经测序证实的RASSF1A甲基化标本分别作为完全甲基化（100％M）和完全末甲基化的标本（0％M），按1：3体积比例混合，作梯度PCR扩增，摸索适当的退火温度。选取单一电泳条带的温度为优化的退火温度，并以这些温度检测70例标本[35对，以同一患者的肿瘤组织（K）、癌旁组织（N）为1对]，比较其在各温度情况时的扩增效果。结果以上指标依年龄（70岁以L／70岁以下）不同出现不同的变化趋热；似然比分析数值均介于0．1—10之间；70岁以下组阳性预测值大多〉70岁以上组；若定义64℃以上温度为高温段，63．3℃以下温度为低温段，则低温段70岁以下组阴性预测值〉70岁以上组，高温段70岁以卜组〉70岁以下组。结论与普通PCR类似，甲基特异性PCR可以通过调接退火温度来改变其俭测效能，但温度变化间隔最好不要〈1℃；应用甲基特异性PCR检测RASSF1A甲基化可以作为膀胱肿瘤早期诊断的辅助方法，在较低年龄组的应用价值高于高年龄组，尤其是在排除肿瘤方面。