不同转移潜能的肝癌细胞系定量磷酸化蛋白质组学研究

目的研究具有不同侵袭转移能力的肝癌细胞系的磷酸化蛋白质组的动态变化。方法首先用含有重稳定同位素标记的精氨酸和赖氨酸的培养基对MHCC97-L进行重稳定同位素标记氨基酸的细胞培养(SILAC);用含有轻稳定同位素标记的精氨酸和赖氨酸的培养基对MHCC97-H进行SILAC标记。将完成标记的两种肝癌细胞系的蛋白质按照1∶1混合,并用trypsin进行溶液消化;对消化得到的肽段进行除盐,并通过固相金属离子亲和色谱(IMAC)的方法进行磷酸化肽段的富集。磷酸化肽段通过质谱进行检测,并通过MaxQuant进行鉴定和定量。最后通过Z检验进行统计学分析,并对差异调控的磷酸化肽对应的蛋白质进行基因本体(GO)分析和STRING网络分析。结果最终鉴定了918个磷酸化肽段,其中806个磷酸化肽段的磷酸化位点可以定位和定量。通过Z检验,共得到了91个磷酸化修饰水平发生变化的肽段,对应25个磷酸化蛋白质。通过对这25个蛋白质进行GO分析发现,细胞骨架重塑过程中的蛋白质在MHCC97-L和MHCC97-H中磷酸化修饰形式严重失调。通过STRING分析发现,NES和PRKCA处于网络的重要节点位置。结论细胞骨架重塑这一生物学过程与肝癌侵袭转移能力密切相关;参与细胞骨架重塑的NES蛋白和参与MAPK信号通路和黏合斑信号通路的PRKCA蛋白磷酸化修饰水平的变化是影响低转移潜能MHCC97-L细胞向高转移潜能细胞MHCC97-H变化的重要调控机制。

肾透明细胞癌非标记定量蛋白质组学及磷酸化修饰组学分析

目的:应用非标记定量蛋白质组学分析技术,筛选与肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)发病机制相关的蛋白质,发现ccRCC新的诊疗靶点。方法:选取2017年01月至2020年12月在新疆医科大学附属肿瘤医院泌尿外科手术治疗并经术后病理证实的ccRCC及癌旁组织样本30例,利用非标记定量蛋白质组学及磷酸化修饰组学技术,分析差异表达的蛋白质及磷酸化修饰位点。生物信息学分析关键蛋白激酶、磷酸化位点以及信号通路。结果:组学联合分析策略共鉴定到2552个差异总蛋白、3024个差异表达的磷酸化位点及与之对应的1572个磷酸化蛋白。功能富集和聚类分析表明差异磷酸化蛋白主要涉及ErbB信号传导途径、VEGF信号传导通路和细胞黏附通路等重要信号通路,其中PDHK1、NDR1、NDR2及MST1可能成为新型候选标志物和药物作用靶点。结论:ccRCC与癌旁正常组织的总蛋白及磷酸化蛋白表达水平存在显著差异,有望成为肾透明细胞癌精准诊疗潜在的研究应用方向。

磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展

蛋白质的磷酸化是一种可逆性的蛋白质翻译后修饰,在生物体内起着极为重要的作用.近年来蛋白质翻译后修饰日益成为蛋白质组研究的热点之一.定量磷酸化蛋白质组学方法和技术的快速发展为研究蛋白质磷酸化时空动态变化,更好地了解生物学功能调节网络奠定了坚实的基础.作为蛋白质组学研究的一个重要组成部分,定量磷酸化蛋白质组学因其磷酸化蛋白质所具有的独特特征,在技术和方法研究方面将面临更为严峻的挑战.综述了磷酸化蛋白质组学定量的一些分析技术和方法的发展现状、优缺点以及未来的发展趋势.

等电聚焦分离与^18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究

磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4～5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19～24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。

磷酸化蛋白质组学联合蛋白质组学分析敲除维甲酸诱导蛋白16对人结肠癌细胞的影响

目的分析人结肠癌HCT116细胞敲除维甲酸诱导蛋白16(RAI16)后细胞内总蛋白及磷酸化蛋白质表达的差异,探究RAI16影响HCT116细胞蛋白质功能的可能机制及相关信号通路。方法收集并提取HCT116 KO和WT细胞蛋白,SDS-PAGE检验蛋白提取效果。利用胰蛋白酶酶解蛋白后,标记肽段并进行质谱分析。对鉴定到的差异蛋白及差异磷酸化蛋白质利用GO数据库、KEGG数据库和STRING数据库进行生物信息学分析。结果SDS-PAGE结果提示蛋白无明显降解,且实验组与对照组部分关键条带有明显差异;按Foldchange≥1.5或Foldchange≤1/1.5且P<0.05为条件进行差异蛋白的筛选,共筛选出147个上调差异蛋白和230个下调差异蛋白;并筛选到106个上调磷酸化位点和217个下调磷酸化位点。将去本底差异磷酸化位点功能GO富集分析,发现差异蛋白主要在核质、细胞核及细胞质组成,RNA、钙黏着蛋白及染色质结合,DNA修复、RNA剪接及DNA为模板转录的正调控等多个方面有显著富集趋势。KEGG富集结果显示,差异蛋白主要在核质转运、剪接体、细胞周期、细胞间紧密连接、病毒致癌作用和癌症中的微小RNA等通路具有显著富集趋势。蛋白互作网络主要以DDX17、NCL、EEF2、CDK1、SSRP1和SMARCC1为核心蛋白质。统计发现,SKP1、ORC1和BAD等两组学差异变化均上调,且磷酸化差异变化比蛋白差异变化更显著,RBL1、RB1、CDK1、CDC6、MCM4、TFDP1、CHD4和SNW1等两组学差异变化均下调,且磷酸化差异变化比蛋白差异变化更显著。结论RAI16可能通过SKP1、ORC1、RB1和CDK1等关键蛋白质在多方面生物功能和多条信号通路中发挥作用,影响细胞周期,进而影响癌症发生发展。

基于质谱的磷酸化蛋白质组学:富集、检测、鉴定和定量

磷酸化是一种调控生命活动的重要翻译后修饰,调控生物的生长发育、信号转导、以及疾病的发生发展.从上世纪80年代开始,质谱应用于蛋白质磷酸化的检测中,极大地推动了磷酸化蛋白质组学的发展.质谱检测拥有高灵敏度、高通量的特点,更重要的是具有位点分辨率,因此基于质谱的磷酸化蛋白质组检测方法得到不断的发展和推广.常见的磷酸化蛋白质组研究,首先对磷酸化肽段进行富集,然后进行串联质谱分析,最后通过搜索引擎对修饰位点进行鉴定和定量.本文从这个三个基本方面,对磷酸化蛋白质组研究进行综述,并对未来研究发展方向进行讨论.

定量蛋白质组学技术在口腔鳞细胞癌中的应用进展

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,已经逐渐成为全球性的公共卫生问题,预防及早期诊断是减轻其负担的主要目标。定量蛋白质组学技术可用于定量细胞、组织或生物体的总体蛋白质含量,近年来被用于探索OSCC特异性的生物学标志物,研究其发病机制,寻找特异性治疗靶点等,为OSCC的早期诊断及治疗提供新思路。

模拟高原低压低氧暴露小鼠记忆损伤与脑海马体磷酸化蛋白质组学分析

目的观察低压低氧致小鼠记忆损伤及脑海马体蛋白磷酸化修饰水平的变化,探寻低压低氧引起记忆损伤的关键磷酸化修饰蛋白和通路。方法40只7~8周龄雄性C57BL/6小鼠,体质量(20±2)g,按体质量顺序编号后采用随机数字表法分为常氧组和低压低氧组(n=20)。常氧组小鼠在常氧条件下喂养,低压低氧组小鼠在模拟海拔6000 m的低压舱中喂养7 d。低压低氧暴露结束后进行Morris水迷宫实验和脑海马体组织磷酸化蛋白质组学检测。结果Morris水迷宫实验结果显示,与常氧组相比,低压低氧组小鼠逃避潜伏期显著延长[(89.66±3.27)vs(38.61±4.83)s,P<0.01]、游泳距离显著增加[(959.21±99.61)vs(550.39±59.43)cm,P<0.01]。磷酸化蛋白质组学分析共检测到显著差异表达磷酸化肽段136个,其中上调92个,来自79个蛋白;下调44个,来自42个蛋白。GO富集分析结果显示:这些差异磷酸化修饰蛋白主要分布在突触后密集区、非对称性突触和基底细胞膜,主要参与细胞连接组装、突触构成、突触中囊泡介导的运输、树突发育、认知等生物学过程。KEGG通路富集分析显示:差异磷酸化修饰蛋白质主要富集在胰岛素分泌、胰液分泌、谷氨酸能突触、内吞和长时程抑制等信号通路。在蛋白质相互作用层面,构成以AGAP2、SYNGAP1、DRP2、DRP3和PSD93等蛋白为核心的蛋白互作网络。结论低压低氧可致小鼠记忆损伤脑海马体磷酸化修饰蛋白及通路发生改变,AGAP2、SYNGAP1、DRP2、DRP3和PSD93可能是关键蛋白。

寄生虫蛋白质磷酸化修饰及磷酸化蛋白质组学研究进展

蛋白质的磷酸化修饰是生命体内一种重要的且普遍存在的蛋白质翻译后修饰方式之一,蛋白质的磷酸化和去磷酸化是一种动态的生物调节过程,在生命过程中起着重要的作用。论文介绍了蛋白质磷酸化修饰的研究进展及其在寄生虫领域中的应用,并对其研究前景进行了展望。

人胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞间酪氨酸磷酸化的比较蛋白质组学研究

比较人正常胃黏膜上皮细胞GES-1与人胃癌细胞SGC-7901间酪氨酸磷酸化蛋白质的差异,筛选差异磷酸化蛋白质分子,为揭示胃癌发生发展的分子机制提供新的理论依据。采用免疫沉淀方法从人胃黏膜上皮细胞GES-1与人胃癌细胞SGC-7901总蛋白质中免疫沉淀出酪氨酸磷酸化蛋白质,用SDS-PAGE和二维凝胶电泳技术分离沉淀出的酪氨酸磷酸化蛋白质,银染,差异蛋白点进行胶内酶解,采用MALDI-TOF/TOF-MS质谱进行差异蛋白质鉴定。结果显示获得了7个差异酪氨酸磷酸化蛋白质,这些蛋白质涉及细胞骨架、细胞调控等。通过比较正常胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞内酪氨酸磷酸化蛋白质的差异,筛选获得7个差异酪氨酸磷酸化蛋白质分子,有助于深入研究胃癌发生发展的分子机制,进而为胃癌的早期诊断和防治提供新的理论依据和作用靶标。

草莓响应炭疽菌侵染的差异磷酸化蛋白质组学分析

以不同炭疽病抗性的草莓品种‘红颊’和‘甜查理’的茎组织为试验材料,采用非标记定量磷酸化蛋白质组学技术分析其在炭疽菌侵染胁迫后磷酸化蛋白组的变化。结果表明,‘红颊’和‘甜查理’中分别有154个和173个磷酸化蛋白在病菌侵染后发生了1.5倍以上的差异表达。功能注释归类分析发现,大部分差异磷酸化蛋白参与了大分子复合体形成及结构定位、刺激应答和信号转导等生物学过程。生物信息学分析进一步表明,相对于易感品种‘红颊’,高抗品种‘甜查理’差异磷酸化蛋白特异性表现出S*Y和T*F 2种保守结构域类型,且植物激素信号传导途径和碳固定途径都发生了更高程度的磷酸化。本研究结果揭示出,这些信号通路在防御病菌入侵过程中发挥了重要作用,为后续深入揭示草莓-炭疽病菌互作分子机制及草莓抗病新品种选育奠定了宝贵的理论研究基础。

磷酸化蛋白质组学技术及其在肿瘤研究中的应用

磷酸化蛋白质组是指机体细胞在特定时间和空间上表达的所有磷酸化蛋白质;磷酸化蛋白质组学是在整体水平上研究磷酸化蛋白质在细胞中的组成成分、表达水平、修饰状态及相互作用规律的学科。近年来,磷酸化蛋白质学技术已广泛应用于肿瘤研究,为阐明肿瘤的发生机制,提高肿瘤的诊治水平提供了重要信息。

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人胃癌SGC-7901细胞的磷酸化蛋白质组学研究

目的研究观察新型维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(ATPR)作用于胃癌SGC-7901细胞后蛋白质的磷酸化情况来了解ATPR诱导分化作用的可能机制和作用靶点。方法 ATPR作用于胃癌SGC7901细胞48 h后,收集并提取总蛋白,通过胰蛋白酶酶解,Ti O2磁珠法富集磷酸肽,高分辨率液质联用仪器检测磷酸肽,使用Proteome Discoverer1.2软件寻找差异的蛋白质和磷酸化位点,利用生物信息学网站和DAVID、KEGG、IPA软件,分析这些磷酸化蛋白质的功能及亚细胞定位等信息。结果最终鉴定出109个蛋白质,其中45个磷酸化蛋白质,共有121个磷酸化位点,差异蛋白中有15个仅出现在ATPR组,20个仅出现在正常组。DAVID分析结果显示差异磷酸化的蛋白质参与调控细胞进程、生物进程、基因表达、细胞的代谢过程等;KEGG分析结果显示差异磷酸化蛋白质主要有参与ERBB信号通路、RNA的转运、内质网蛋白加工过程、p53信号通路等。IPA软件分析一些差异蛋白质之间的关联蛋白是泛素连接酶(UBC)。结论 ATPR对胃癌细胞SGC-7901细胞诱导分化的机制可能是通过作用于多种蛋白质或基因,如肝癌衍生生长因子(HDGF)、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)、ATP结合盒G亚族蛋白4(ABCG4)和腺苷酸环化酶关联蛋白1(CAP1)而发挥作用,并通过影响这些蛋白质的磷酸化从而实现ATPR对胃癌细胞的诱导分化作用。

金属氧化物在磷酸化蛋白质组学研究中的应用

磷酸化肽段的高效富集是磷酸化蛋白质组学中的重要任务,通过综述纳米金属氧化物在磷酸化蛋白组学中的应用,了解磷酸化蛋白组学研究中常用的磷酸化肽段富集材料和方法。该文介绍纳米金属氧化物、核壳结构纳米磁性材料以及金属离子在磷酸化蛋白组学中的富集效果。纳米金属氧化物材料由于其特殊理化性质在富集磷酸化肽段研究中具有特异性强、选择性好特点,在磷酸化蛋白组学研究中得到了广泛应用。虽然纳米金属氧化物在磷酸化蛋白组学的研究中仍然处于起步阶段,可重复性和全面富集仍面临挑战,但是在未来的亚细胞蛋白组学和功能蛋白组学研究中,纳米金属氧化物及其衍生物仍然会起着重要作用。

用蛋白质组学方法研究蛋白质酪氨酸磷酸化

蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式,几乎涉及所有的生理及病理过程,其中酪氨酸残基的磷酸化作为较高级的进化形式和复杂的多细胞生命的特征表现得尤为突出和重要。但目前对酪氨酸磷酸化缺乏大规模和系统性的研究,近年发展起来的蛋白质组学为细胞和组织中的酪氨酸磷酸化蛋白质的系统研究提供了必要的技术。

磷酸化蛋白质组学方法在信号网络解析中的应用

信号转导是细胞对各种外界刺激的应答反应,蛋白磷酸化或去磷酸化是信号从胞外流向胞内并导致细胞效应过程中的关键机制。磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)是采用蛋白质组学的分析方法,研究细胞中所有磷酸化蛋白质及其修饰过程,从整体上观察细胞中被修饰的磷酸化蛋白质的状态及其变化,进而分析特定磷酸化修饰对生命过程的调控作用及其分子机制。

不同来源乳汁外泌体蛋白质及其磷酸化修饰差异分析

目的外泌体是一种由不同类型细胞分泌到胞外的囊泡结构,其粒径范围在30~150 nm,广泛存在于血液、尿液、乳汁等多种生物流体。由于外泌体内部含核酸、脂质、蛋白质等多种生物活性分子,因此被认为是潜在的生物标记物和药物载体。乳汁来源的外泌体获取成本低、生物相容性高且免疫原性低,已被广泛应用于药物递送等领域以治疗相关疾病。目前对于乳汁外泌体磷酸化的研究尚未报道。本文旨在对不同来源乳汁外泌体进行磷酸化蛋白质组学分析,以期寻找其中具有特殊功能的通路与蛋白质,为探索寻找更加丰富多样的疾病治疗手段提供思路。方法利用多肽和磷酸化多肽富集技术,分离牛乳、猪乳、羊乳来源外泌体与乳清中样品进行全蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析,并结合多种生物信息学工具,分析不同来源乳汁外泌体蛋白质信号通路相关信息。结果从上述3种不同物种乳汁外泌体中鉴定到4191种蛋白质,1640种磷酸化修饰蛋白质以及4064个磷酸化修饰肽段,其中不同物种外泌体蛋白质及其磷酸化修饰的种类均明显高于乳清,且不同物种样品中蛋白质种类差异较大,表明外泌体中蛋白质种类与其来源细胞种类和状态密切相关。结果显示,牛乳来源外泌体蛋白质在吞噬作用(由Fcγ受体介导)通路的富集,羊乳外泌体蛋白质显著富集于神经与免疫相关通路,猪乳外泌体所含蛋白质参与多个生命活动的正/负调控。结论本研究将为不同来源外泌体在疾病靶向治疗和载药方面的应用提供理论依据。

结直肠癌蛋白质组学分析及其应用

目的基于LC-MS/MS非标记定量蛋白质组学分析结直肠癌(colorectal cancer,CRC)差异蛋白并筛选与CRC发生相关的关键通路。方法采用LC-MS/MS对3例CRC患者肿瘤组织和癌旁正常组织的蛋白质组进行定量分析,筛选差异蛋白。通过生物信息学分析筛选与CRC发生发展密切相关的候选蛋白并验证。通过TCGA分析筛选CRC潜在标志物。结果蛋白质组学分析共鉴定了4257个蛋白,差异蛋白544个,显著上调蛋白446个,显著下调蛋白98个。基于GO富集分析及KEGG通路分析,发现与RNA和DNA功能相关的蛋白通过调控基因表达和细胞增殖参与了CRC的发生发展。基于此筛选RNA功能相关差异蛋白为候选蛋白:PRPF19、HNRNPM、UTP18、RCL1、RPL3、EIF5、NCBP2、NOP58、RANBP2,随后在另外5例CRC患者肿瘤组织和癌旁组织上进行了表达验证。成功验证出NCBP2、PRPF19、HNRNPM在CRC中表达显著增加,且NCBP2表达水平与患者总体生存率呈负相关。结论本研究筛选了在CRC发生发展过程中具有潜在重要作用的3个差异蛋白,有望作为CRC诊断和治疗的靶标。

博舒替尼抗食管癌细胞的磷酸化蛋白质组学研究

作为一种新型的双重Src/Abl激酶抑制剂,博舒替尼(bosutinib,SKI-606)能够显著抑制食管癌细胞的增殖并促进其凋亡。本文通过检测博舒替尼作用于人食管癌细胞Eca-109后磷酸化蛋白质组的变化,研究了博舒替尼在食管癌中可能的作用靶点及机制。结果显示:在2741个磷酸化蛋白质上共鉴定到11335条磷酸化肽段、7940个磷酸化位点,差异磷酸化肽段为182个,其中上调55个,下调127个;除了抑制Src、Abl外,博舒替尼还显著影响JUN、核糖体蛋白S6、CD44、SFRS蛋白激酶2等蛋白质的磷酸化,而这些差异磷酸化蛋白质主要参与m RNA代谢、细胞骨架组织、锌离子转运等重要生物学过程。KEGG信号通路富集显示,差异磷酸化蛋白质主要涉及转录、翻译、核糖体相关的信号通路。上述结果提示,博舒替尼可能通过影响m RNA代谢、细胞骨架组织及锌离子转运等生物过程中关键蛋白质的磷酸化发挥抑制食管癌的作用,而JUN和核糖体蛋白S6可能是食管癌中博舒替尼的潜在作用靶点。

磷酸化蛋白质组学研究现状

蛋白质磷酸化是生命活动最重要的一项翻译后修饰,与信号转导、细胞周期、生长发育以及癌变机制等许多生物学问题有着密切的关系。蛋白质磷酸化和去磷酸化作为原核和真核细胞表达调控的关键环节,了解其对功能的影响可以深入理解生命系统在分子水平的调控状况。目前磷酸化蛋白质组研究仍是功能基因组面临的重大课题,本文对此作一综述。