定量竞争性RT-PCR检测耐受山梨酸钾的大肠杆菌菌株中acrA-mRNA表达水平

采用含有亚抑菌浓度(1/2×MIC)山梨酸钾的LB琼脂平板连续传代的方法,对大肠杆菌(Escherichia coli)进行诱导,获得具有一定耐受性的大肠杆菌菌株;通过定量竞争性RT-PCR检测诱导后的各个菌株与未经诱导的各个菌株的acrA-mRNA的表达水平。结果表明,各个菌株经过含有亚抑菌浓度山梨酸钾的LB琼脂连续培养10代后获得的诱导菌株,与普通LB琼脂平板连续培养10代后获得的菌株相比可以耐受更高浓度的山梨酸钾,并且acrA-mRNA表达水平在诱导后的各个菌株中比未经诱导的各个菌株均有一定程度的提高。说明大肠杆菌主动外排系统AcrAB-TolC中acrA基因的表达水平提高可能与大肠杆菌对山梨酸钾的耐受程度增加有一定相关性。

竞争性RT-PCR法及对大肠杆菌acrA基因mRNA表达水平的定量研究

建立了用于检测大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922的acrA基因mRNA表达水平的定量竞争性RT-PCR(QC-RT-PCR)体系。PCR合成目标片段的突变型片段(321bp)作为内标准模板(Internal standard,IS),与目标片段一致的片段(389bp)作为目标模板(Target standard,TS),优化两种模板共扩增体系;梯度稀释IS与等量大肠杆菌cDNA样本共扩增,扫描电泳条带,软件分析数据。结果表明,引物设计合适,以IS和TS为模板实现共扩增,产物(321bp和389bp)通过1.5%琼脂糖凝胶电泳有效分离;梯度稀释IS与cDNA共扩增产物出现亮度梯度电泳条带;获得一元回归曲线y=-0.345+0.097x(相关系数r=0.959,标准差s=0.05997)。该研究成功构建内标准模板,优化的共扩增PCR体系实现了对大肠杆菌ATCC25922中acrA基因mRNA表达水平的检测,具有简便、高效、敏感度高等优点。

竞争性RT-PCR测定法及BMP-2mRNA的定量检测

建立竞争性 PCR方法 ,以期用于转录水平基因表达的定量研究 .以检测大鼠颅骨骨细胞总RNA中骨形态发生蛋白 - 2 ( BMP- 2 ,bone morphogenetic protein- 2 ) m RNA含量为例 ,构建大鼠BMP- 2基因的竞争模板 ,以之为内对照进行竞争性 PCR.PCR反应结束后 ,电泳、拍照 ,扫描所扩增条带密度 ,作回归方程 .根据回归方程 ,计算出正常 7d Wistar大鼠颅骨总 RNA中 BMP- 2 m RNA含量为 1 .1 2 5amol/μg RNA.结果显示 ,成功构建了大鼠 BMP- 2基因的竞争模板 ,建立了可以测定大鼠颅骨骨细胞总 RNA中 BMP- 2 m RNA含量的竞争性 PCR方法 .

竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达

目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。

改进竞争性RT-PCR法在定量PER1基因表达中的应用

目的研究使用不同样品稀释液及变性高效液相色谱(DHPLC)梯度条件对定量检测PER1基因表达的影响。方法竞争性RT-PCR与DHPLC结合定量检测基因表达。结果样品稀释液中含有载体可极大提高实验的重复性、准确性;不同DHPLC梯度条件对定量结果无明显影响。结论建立定量PER1基因mRNA表达水平的竞争性RT-PCR系统有助于精确检测微量标本中节律基因表达的变化,探寻生物节律与疾病状态间的关系。

猪IFN-γ mRNA竞争性RT-PCR定量检测方法的建立

无菌分离的猪外周血单个核细胞(PBMC),经ConA体外刺激培养15 h后提取细胞总RNA。以此总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到了435 bp的IFN-γ基因。把扩增到的IFN-γ基因与pMD18-T载体连接,构建了pMD-IFN435重组质粒。用另一对引物对重组质粒pMD-IFN435内部进行PCR扩增,得到了257 bp(含PstⅠ酶切位点)的基因片段,将此基因片段连接到pMD18-T载体上构建了pMD-IFN257重组质粒。将pMD-IFN257双酶切(PstⅠ+SalⅠ)后回收的目的片段与pMD-IFN435双酶切(PstⅠ+SalⅠ)后回收的目的片段连接,得到了含有367bp目的片段的重组质粒pMD-IFN367,即内标准DNA模板。以定量后的pMD-IFN367与2倍梯度稀释的pMD-IFN435进行竞争PCR扩增,建立了能够准确、方便定量检测猪IFN-γmRNA的标准竞争曲线的线性回归方程(y=0.414x-1.864)。

竞争性RT-PCR法定量分析骨巨细胞瘤中TGFβ-1 mRNA的表达水平

目的 用竞争性PCR法检测骨巨细胞瘤（GCT）中TGFβ- 1mRNA，分析其对肿瘤预后的意义。方法 通过RT- PCR法制备内标和外标，将等量的内标和等比稀释的外标进行竞争性共扩增，得到标准曲线，然后将等量的内标和cDNA标本共扩增，通过标准曲线求出标本中TGFβ- 1mRNA的水平，并与GCT分级进行对比。结果 内标和外标在共扩增中表现出很强的竞争性。GCT中TGFβ- 1 mRNA的表达水平随着肿瘤分级的上升明显增加，局部复发和肺转移的标本中TGFβ- 1mRNA表达水平较未复发的标本高。结论 竞争性RT- PCR是一种灵敏，简便、快速检测GCT中TGFβ- 1mRNA表达水平的方法。应用该方法和肿瘤病理分级标准来综合判断肿瘤的预后，有着重要的临床意义。

竞争性PCR定量检测鸡传染性贫血病毒核酸

将删除33个碱基序列的CAVDNA克隆进质粒pSBII,提取质粒DNA,经过纯化、定量后作为竞争性模板,建立了一种定量检测鸡传染性贫血病毒核酸方法。该方法能够检测出的最低CAVDNA为103.5Molecules/μL,其精确度可达到100.5Molecules/μL。该方法与传统方法相比,具有节省时间、节约试剂和受其它因素干扰小等特点。

猪TNF-α竞争定量RT-PCR标准曲线的建立

根据GenBank中猪TNF-α的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增402 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,构建成含TNF-α部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增402 bp片断共用同一对引物,但缺失137 bp的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立猪TNF-α的标准竞争曲线和直线回归方程.

竞争性RT-PCR检测哮喘患者IL-8表达水平

利用反向ＰＣＲ法，缺失人ＩＬ－８ｃＤＮＡ内部ｂｐ序列，构建得到ＩＬ－８突变内标分子．用 已知量的该内标分子，通过竞争性ＲＴ－ＰＣＲ法、检测支气管哮喘患者外周血ＩＬ－８基因的表达情 况，发现患者ＩＬ－８ｍＲＮＡ的表达水平明显高于正常人对照组．这一结果初步表明，利用竞争 性ＲＴ－ＰＣＲ技术对支气管哮喘息者进行早期基因诊断，具有一定的可行性。

猪IL-12p40竞争定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒.利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组子.通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立了猪IL-12p40的标准竞争曲线和直线回归方程.

应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的:建立竞争性荧光定量聚合酶链反应(CFQ-PCR),并探讨CFQ-PCR在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义.方法:根据HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,和一条特异的TaqMan探针;根据上述引物序列,采用分子克隆技术制备内对照DNA;再根据内对照序列合成一条内对照DNA特异的与上述TaqMan探针不同标记的TaqMan探针;将适量的内对照DNA加入到PCR反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增.结果:在30μL CFQ-PCR反应体系中,加入约20拷贝内对照DNA能够稳定地获得共扩增曲线;经琼脂糖凝胶电泳分析,加入约100-500拷贝内对照DNA能够有效地获得共扩增产物条带信号;在210个临床HBsAg阳性血清标本的CFQ-PCR扩增中识别出8个未能有效扩增的标本,60份HBsAg阴性血清标本中识别出2个内对照未能有效扩增的标本,后经DNA纯化处理,上述全部标本的内对照均获得阳性扩增结果,其中有7个HBsAg阳性血清标本获得HBV DNA扩增阳性结果.结论:CFQ-PCR能够有效地提示临床标本HBV DNA体外扩增时由于扩增失败导致的假阴性,适合临床推广应用.

一种较为简单的用竞争性内标准作定量PCR的方法及其准确性

目的 介绍一种较为简单的定量PCR方法 ,并检测该方法的准确性。方法 以PCR引入缺失突变的方法制作竞争性DNA内标准 ,使它略小于目的DNA扩增的片段。将竞争性内标准和标本放在一管中扩增 ,以两种PCR产物之比从标准曲线求得标本中目的DNA的含量。结果 同一标本不同加样量测定大鼠肺cDNA中内皮素 - 1(ET - 1)cDNA含量 ,结果之间的最大误差为 6 .3%。重复试验测定大鼠肺cDNA中胱硫醚γ裂解酶 (CSE)cDNA含量 ,批内误差为± 7.3% ,批间误差为± 3.1- 8.5 %。结论 本法的竞争性内标准容易制作 ,定量方法较为简单 ,误差不大 ,能符合大多数检测的要求。

人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的竞争性逆转录-聚合酶链反应定量分析

为建立人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达检测方法 ,研究载脂蛋白E基因与儿童健康的关系 ,我们抽取 2 6例健康儿童外周静脉血 ,分离血单核细胞 ,抽提RNA ,采用逆转录—聚合酶链式反应检测载脂蛋白E基因表达 ,并以正常人cDNA作定量标准物 ,待测样品与定量标准物共扩增 ,计算出待测样本的个体的mRNA量。研究发现载脂蛋白E基因能在健康儿童周围血单核细胞表达 ,健康儿童载脂蛋白E基因表达量为 0 .37± 0 .15mol/molmRNA。表明采用竞争性逆转录—聚合酶链反应方法来检测人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的分析方法快速、简便、灵敏、实用、可靠 ,且能准确定量 ,值得推广应用。

定量测定羊关联性恶性卡他热病毒DNA的竞争性PCR方法的建立

此项研究中建立了用于定量测定羊关联性恶性卡他热 (Sheep- associated malignant catarrhal fever,SA- MCF)病毒 DNA的竞争性聚合酶链反应 (Comppetitive polymerase chain reaction,c PCR)方法。该分析中采用同一引物 ,分别将一固定但未知含量的待测目的 DNA(target DNA)与一系列已知含有不同拷贝数量的竞争性 DNA(com petitive DNA)同时扩增。经4 0次扩增后 ,在 30～ 30 0 0 0 0 DNA拷贝范围内 ,目的 DNA与竞争性 DNA之间其扩增产物具有明显的线性竞争关系 (r=0 .98)

猪IFN-γ竞争定量RT-PCR标准曲线的建立

根据GenBank中猪IFN-γ的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增380bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-TEasy载体中,构建成含IFN-γ部分基因片段的重组质粒。利用反向PCR技术构建和扩增380 bp片段共用同一对引物但缺失163 bp的竞争重组子。通过重组质粒与竞争重组子,建立猪IFN-γ的标准竞争曲线和直线回归方程,为进一步检测IFN-γ的mRNA的转录水平变化奠定基础。

竞争性定量PCR检测恶性血液病造血干细胞移植术后克隆性TCRVγI-Jγ基因重排

目的 :为提高恶性血液病患者微小残留病 (MRD)检测的临床意义。方法 :构建竞争性定量聚合酶链反应 (PCR)检测技术并定量分析 3 1例恶性血液病患者 (包括 12例急性淋巴细胞白血病 ,10例急性非淋巴细胞白血病 ,6例非霍奇金淋巴瘤和 3例慢性粒细胞白血病 )造血干细胞移植术后TCRVγI Jγ基因重排。结果 :建立定量PCR方法的灵敏度为 10 -5水平 ;3 1例恶性血液病造血干细胞移植术后 1个月MRD的水平为 (3 16± 2 74)× 10 -5,移植后 1个月MRD水平显著低于移植前 [(4 2 1± 3 2 7)× 10 -5] (P <0 0 2 5 ) ;2 2例自体造血干细胞移植术后MRD为(3 47± 2 91)× 10 -5水平 ,显著高于 9例异基因造血干细胞移植术后 [(2 63± 2 2 1)× 10 -5] (P <0 0 5 ) ;MRD >40 0×10 -5的 13例病人中 2年内复发率为 5 3 8% (7/13 ) ,而MRD <40 0× 10 -5的 18例病人中仅有 2例 (11 1% )出现复发。MRD >40 0× 10 -5患者 2年内的复发率显著高于MRD <40 0× 10 -5患者 (P <0 0 1)。结论 :所构建竞争性定量PCR技术简便、快速、灵敏 ;定量检测恶性血液病造血干细胞移植术后MRD水平有利于预后预测。

采用竞争性定量PCR检测幽门螺杆菌cagA基因

目的建立竞争性定量 PCR 检测幽门螺杆菌 cagA 基因的方法。方法以重组 PCR 将乳糖操纵子中 Lac 阻抑蛋白特异性结合序列(21bp)重组入 cagA 基因397bp 的片段中构建内参标模援(rfcagA)。体外克隆并表达具有双功能的 GST-LacI 融合蛋白,其一端只有 GST 酶活性,另一端可特异性地与重组内参标模板结合。在定量 PCR 中,以 rfcagA 为内参标模板,pMC3 或 Hp 基因组 cagA 作为竞争性模板,PCR 产物的5′-端标记了生物素,可与包被了亲和素的微孔板结合,只有 rfcagA 的 PCR 产物可与融合蛋白结合而显色。结果 GST 底物的显色程度与样本的 ca-gA 含量呈负相关,当反应体系中的起始模板量为10-10~5拷贝,循环次数小于等于20次。原始模板数以指数方式增长,并建立了原始模板的考贝数与 A_(340)值同的标准曲线。用该方法检测12份已知菌株中的 cagA 含量,8份 cagA 阳性,cagA 基因的拷贝数为6.3×10^(10)-2.14×10^(11)/L,特异性为100%,敏感度达可检出 cagA 基因2倍的差别。结论这是一个特异、敏感及很实用的定量检测 cagA 基因的方法。

烟草转基因内标准定量检测中竞争性模板的制备

以转基因烟草为材料,通过DNA提取、PCR扩增获得NOS终止子片段产物,以重叠延伸扩增法制备该片段的竞争性模板,并进行酶切验证。