SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系

目的建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法基于马铃薯内参UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量限、检测准确度进行评估。结果该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于0.86%~22.90%,线性决定系数r^(2)>0.99;品系特异性基因的定量限为3拷贝;不同浓度样品EH92-527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和–1.31。结论方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

定量荧光聚合酶链式反应在流产组织染色体畸变分析中的诊断价值

目的评估在以拷贝数变异测序(CNV-seq)为主要遗传学检测手段对流产组织进行染色体畸变分析中辅以定量荧光聚合酶链式反应(QF-PCR)检测的诊断价值。方法采用QF-PCR及CNV-seq技术同时检测2021年9月至2022年11月海口市妇幼保健院收集的110例流产组织样本。此外,QF-PCR技术将额外检测50例健康人群外周血样本进行数据补充。QF-PCR体系为自建体系,在13、18、21、性染色体共选择17个位点并将其分为两组。Panel A组由D13S796、D13S256、D18S386、D18S535、D21S11、D21S1446、DXS6809、HPRT构成;Panel B组由D13S371、D13S634、D18S51、D18S535、D18S819、D21S1409、D21S1412、DYS218、DXS981、AMEL构成。分析QF-PCR在判别13、18、21、性染色体非整倍体时与CNV-seq结论一致性、QF-PCR为CNV-seq进行母源污染鉴定能力,以及QF-PCR进行13、18、21、性染色体非整倍体的分型能力。结果对110例流产组织进行检测,两种方法结论一致例数占比为93.6%。其中QF-PCR避免了5例CNV-seq自身局限性造成的不准确结论,2例为QF-PCR的检测失败。在母源细胞污染鉴定能力上,15个短串联重复序列的观察杂合度、期望杂合度与个体识别能力值范围分别为0.737~0.950、0.593~0.941、0.817~0.975;D13、D18、D21与DX的累积He依次为0.9999、0.9998、0.9998与0.9985,累积个体识别能力大于0.999999999999999999999999999999;自建的QF-PCR方法在分型能力上表现良好,其干扰因素影响较小。结论QF-PCR联合CNV-seq检测可能成为未来孕早期流产组织遗传学分析的主要方法。它不仅能够降低CNV-seq的误诊率、鉴别母体细胞污染。采用自建QF-PCR体系还能够显著降低联合检测成本。

Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。

利用可视基因膜芯片技术与实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析肉制品中动物源性成分

为调查了解肉制品中动物源性成分,以帮助判别掺假情况,应用可视基因膜芯片检测技术对市售的肉松、香肠、肉卷、预制调理肉、肉干及肉脯等23份样品动物源性成分进行筛查分析,同时,针对筛查结果采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法进一步确证。结果表明:可视基因膜芯片检测法与实时荧光定量PCR法检测结果一致,提高了未知样品的筛查效率;在本次随机分析的样品中,动物源性成分检测结果与标签标示不一致的情况占比高达21.7%,肉制品掺假虚标情况不容忽视。

冬虫夏草微滴式数字聚合酶链式反应定量检测方法的建立及应用

目的建立一种定量检测冬虫夏草菌的微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法,探讨其定量检测冬虫夏草的可行性。方法使用冬虫夏草菌特异性引物和探针建立ddPCR检测方法,对冬虫夏草及其常见伪品进行鉴别,对其特异性和自制混伪品进行检测和评估,并采用该方法对市场流通的冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分进行检测。结果ddPCR检测方法对冬虫夏草菌具有良好的检测特异性,且在掺伪0%~70%范围内定量检测的准确性高;此外,对冬虫夏草及其制剂市售样品的检测结果显示,该方法可用于冬虫夏草的定量检测。结论ddPCR检测方法可成功检测市售冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分,具有市场应用价值,可为含冬虫夏草成分的保健食品和药品提供定量和鉴伪检测依据。

微滴式数字聚合酶链式反应精准定量检测羊肉中掺杂猪肉

以羊和猪的单拷贝持家基因DNA复制蛋白A1为靶基因设计合成了适用于微滴式数字聚合酶链式反应的特异性引物和探针,通过理论推导获得了单位质量两种肉基因拷贝数之比的固定值,并进行了验证,据此将样品中羊肉和猪肉的拷贝数转换为相对质量分数,从而建立了羊肉中掺杂猪肉的精准定量检测方法。该方法可以很好地应用于羊肉中掺杂猪肉的含量检测,猪肉的最低定量限为1%,在5%~80%范围内绝对误差小于±1.30%,相对误差小于±10%,定量结果准确、重复性高,可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术参考。

荧光定量聚合酶链式反应法检测婴儿尿液人巨细胞病毒DNA对人巨细胞病毒感染的诊断意义

目的探讨荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)方法检测婴儿尿液人巨细胞病毒(HCMV)DNA水平对婴儿HCMV感染的诊断价值。方法采用FQ-PCR检测348例临床疑似HCMV感染婴儿尿液中HCMVDNA水平。同时采用化学发光免疫分析法(CLIA)检测婴儿血清HCMV-IgM抗体。在尿液HCMVDNA检测阳性患儿中比较血清HCMV-IgM抗体检测阳性与阴性患儿尿液中HCMVDNA拷贝数差异。结果FQ-PCR检测尿液HCMVDNA的阳性率为41.74%,CLIA检测婴儿血清HCMV-IgM抗体的阳性率为19.83%。2种方法对HCMV感染诊断的符合率为76.7%。前者诊断阳性率显著高于后者(χ2=69.44P<0.01)。在尿液HCMVDNA检测阳性患儿中,IgM抗体阳性组尿液HCMVDNA拷贝数显著高于阴性组(P<0.01)。结论FQ-PCR检测尿液HCMVDNA是早期诊断婴儿HCMV感染的敏感有效的方法。HCMV感染婴儿尿液中高HCMVDNA拷贝数与活动性HCMV感染密切相关;FQ-PCR方法检测尿液HCMVDNA水平对于判断是否为HCMV活动性感染具有一定意义。

常见转基因大米数字聚合酶链式反应多重定量检测方法研究

目的建立4种转基因(geneticallymodified,GM)大米成分多重定量检测方法,解决混合转基因产品和多品系杂交的多价转基因产品高通量精准定量难题。方法采用Raindrop微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法对4种常见转基因大米TT51-1、克螟稻、科丰6号、M12品系特异性基因和大米蔗糖磷酸合成酶基因逐一进行拷贝数分析,并将其转化为含量百分比。结果转基因含量在0.1%~100.0%范围内的4个品系转基因大米混合样品的定量体系线性关系良好,标准曲线r2值均在0.99以上,定量相对灵敏度可达0.1%,相对误差和相对标准偏差值均小于25%,定量准确性和精密度符合国际通用要求。结论本研究成功建立了4种常见转基因大米成分的多重定量检测方法,解决了常规方法一次只能定量分析单一样品的缺点,为大米、稻谷及其初加工产品中多种转基因成分的高效定量提供了新的技术手段。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

定量聚合酶链式反应研究新疆小河古代样本的DNA

利用定量聚合酶链式反应来检测PCR起始阶段的古DNA模板数是鉴定古DNA保存状况以及确保其真实性的有效方法之一。采用SYBRgreenI法对距今3800年左右的新疆小河墓地出土的5例样本线粒体DNA的3个不同长度片段(138bp、209bp和363bp)及核DNA(AMG基因)进行定量。线粒体DNA定量结果显示:小河样本古DNA扩增效率与扩增序列长度成负相关性,只有138bp的结果高于每微升150拷贝。虽然大部分小河样本的AMG基因定量结果都在30拷贝以内,仍然可以进行核DNA的STR或SNP分析。本实验首次通过定量PCR的方法,证明在同一个体中的牙齿中的DNA拷贝数要高于骨骼中的。

检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应方法的建立

以鲜切叶菜中的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)为研究对象,建立定量检测E.acetylicum的双重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法。以前期试验发掘到的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)的特异性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特异性基因oxi_50582462为检测靶点,对其设计特异性探针,并对反应体系进行优化,以12株E.acetylicum为阳性对照,以4株微小杆菌属内其他种的菌株以及10株非微小杆菌的腐败菌/致病菌作为阴性对照,对建立的RT-PCR进行特异性检测;通过标准曲线的制备、灵敏度、可重复性来评价该方法的有效性。最后,应用该RT-PCR方法对不同贮藏日期鲜切叶菜中的E.acetylicum进行检测。结果表明:本研究设计的探针特异性良好;检测靶点P401_RS0117025与oxi_50582462的标准曲线的R2值分别为0.994和0.999,且重复性好;该方法的DNA检测限为1.629×10^(-7)ng/μL,纯菌菌落检测限为3.4 CFU/m L,并能对鲜切叶菜中的E.acetylicum进行灵敏检测。此外,还建立了"Ct(阈值)-Nt(菌体浓度)"的数量关系,能对供试样品中的E.acetylicum进行绝对定量。总之,本研究建立了准确、灵敏、高效检测食品中腐败菌E.acetylicum的RT-PCR定量方法,为食品货架期预测提供了理论依据。

基于定量聚合酶链式反应技术的多囊卵巢综合征与促卵泡激素的受体基因多态性的相关性研究

目的多囊卵巢是造成不孕和子宫内膜癌等疾病的重要因素之一,该研究目的是探索多囊卵巢与相关单核苷酸的多态性位点相关性。方法该研究首先提出了一种改良的等位特异的定量聚合酶链式反应技术并对其进行了可靠性评估,随后对多囊卵巢患者和对照样本进行了卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点进行了分型鉴定。结果该研究结果显示其提出的改良的定量聚合酶链式反应方法进行单核苷酸的多态性位点分型准确度高,区分度好,与Sanger测序法获得的结果完全一致,能够很好的用于单核苷酸的多态性等多态性位点的分型鉴定;该实验对152例多囊卵巢患者和152例对照样本中卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点分型检测结果显示Thr307Ala和Asn680Ser两个位点的等位基因频率和基因型频率均呈现了与多囊卵巢之间的显著相关性。结论该研究结果表明卵泡刺激素受体基因的两个单核苷酸的多态性位点可能与多囊卵巢的发病密切相关,为深入探讨该疾病和进一步研究单核苷酸的多态性分型奠定了基础。

定量聚合酶链式反应技术检测骨关节炎软骨组织中纤维连接蛋白mRNA的表达水平

目的: 探讨纤维连接蛋白(FN)mRNA表达水平的变化与骨关节炎的关系。方法:采用石膏管型固定右膝关节,人工制作骨关节炎动物模型作为实验组,另设对照组,采用定量聚合酶链式反应方法检测FNmRNA表达水平的变化。结果:Wistar鼠正常膝关节的软骨组织与人工制造膝关节骨关节炎的软骨组织中均存在FNmRNA表达,但其表达水平在骨关节炎的软骨组织中显著低于正常膝关节的软骨组织(P<0.01)。结论:软骨组织中FAmRNA表达水平降低可能是骨关节炎发生和难以愈合的原因之一。

荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究

目的 评价荧光定量聚合酶链式反应 (FQ- PCR)检测恶性疟原虫的效果。 方法 以不同浓度梯度标准对照作为参照 ,对 12 7份疟区血样进行检测 ,并将所得结果与镜检、常规 PCR法比较。 结果 恶性疟原虫镜检、常规 PCR、FQ- PCR检出的阳性率分别为 33.1%、38.5 %和 40 .9% ;定量检测结果与镜检阳性率呈直线相关 ,相关系数为 0 .96 1。 结论 FQ- PCR检测方法有较高的灵敏度和特异度 。

反转录聚合酶链式反应定量分析Ⅰ型脱碘酶的mRNA

Ⅰ型脱碘酶 (IDⅠ )是一种含硒酶 ,它在甲状腺激素代谢中起重要作用。本实验建立了利用RT PCR并以 β 肌动蛋白 (β Actin)为内参照定量分析IDⅠmRNA表达的方法。提取肉鸡肝脏总RNA ,经反转录和PCR扩增 ,PCR产物的电泳条带于VDS摄象系统扫描灰度。寻求PCR线性扩增范围 ,确定RT PCR的最佳循环次数和模板量。通过计算IDⅠPCR产物与β ActinPCR产物的灰度之比 ,即可得出IDⅠmRNA的相对含量。

荧光定量聚合酶链式反应种植前胚胎β-地中海贫血基因诊断

目的 用荧光定量聚合酶链式反应 (PCR)方法进行种植前β-地中海贫血一种中国人常见突变类型 CD4 1/ 4 2 (- TCTT)的基因诊断。 方法 来源于β-地中海贫血病人或携带者的 2 89个淋巴细胞和人体外受精 -胚胎移植志愿者剩余的胚胎分离 137个单细胞用荧光定量 PCR方法进行分析。 结果 用单个淋巴细胞诊断β-地中海贫血扩增效率达 96 % ,准确率达 99%～ 10 0 % ,等位基因丢失 (ADO)率仅 0～ 5 %。单个胚胎细胞扩增效率 86 %。 结论 荧光定量 PCR技术是一种敏感、快速、可靠和准确的技术 ,适合包括β-地中海贫血在内的单基因疾病的种植前诊断。

实时荧光聚合酶链式反应技术在慢性乙型肝炎患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值

目的探讨实时荧光聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术在慢性乙型肝炎(CHB)患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值。方法选取2015年4月至2018年6月南阳市第二人民医院收治的109例CHB患者作为研究组,同期81例HBV早期感染者作为对照组。均以FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平,同时研究组接受拉米夫定治疗,采用FQ-PCR技术动态监测血清标本HBV DNA变异情况,对比两组入院首次HBV DNA表达水平及研究组治疗前后HBV DNA表达水平和变异率。结果入院首次检测研究组HBV DNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。经单因素方差分析,治疗后3、6、9个月HBV DNA表达水平对比,差异有统计学意义(P<0.05);两两对比,治疗后9、6个月HBV DNA表达水平低于治疗后3个月,治疗后3个月低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后9个月HBV DNA变异率高于治疗后6个月,治疗后6个月高于治疗后3个月、治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。结论实时FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平可客观反映HBV感染、复制活性,可为临床诊断、疗效评估提供数据支持。

荧光定量聚合酶链式反应法在常见食源性致病细菌检测中的应用价值

目的探究荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在常见食源性致病细菌检测中的应用价值。方法将菌株及样品经培养基增菌后,分别采用荧光定量PCR和常规的细菌培养检测致病菌,比较两组检出情况。结果 720个样品,采用细菌培养方法检测出了沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血性弧菌等几种常见致病菌;细菌培养法与荧光定量PCR法对致病菌的阳性检出率分别为11.94%和12.50%,差异无统计学意义(>0.05),在不同种类食品中两种方法的检出率差异无统计学意义(>0.05)。结论荧光定量PCR检测应用于食源性致病菌检测,检测速度快,准确性高。