定量蛋白质组学技术在口腔鳞细胞癌中的应用进展

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,已经逐渐成为全球性的公共卫生问题,预防及早期诊断是减轻其负担的主要目标。定量蛋白质组学技术可用于定量细胞、组织或生物体的总体蛋白质含量,近年来被用于探索OSCC特异性的生物学标志物,研究其发病机制,寻找特异性治疗靶点等,为OSCC的早期诊断及治疗提供新思路。

基于TMT标记定量蛋白质组学技术研究中药复方益糖康改善db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制

目的研究db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗的发病机制及中药复方益糖康对其的改善作用。方法9周龄健康雄性SPF级db/db小鼠16只、db/m小鼠8只,分别设置模型组、益糖康组、空白组,益糖康组使用30 g·kg^(-1)·d^(-1)的中医复方益糖康煎剂进行灌胃,其余两组予以等体积的生理盐水灌胃,5周后进行取材,分离各组小鼠的骨骼肌组织。所有样本经TMT 10标试剂进行标记定量、蛋白酶解、TMT肽段标记与肽段分级、LC-MS/MS分析后,用数据库检索方法确定差异蛋白,并进行生信分析。结果所选取的样本稳定,有较高的科学价值;与db/m正常小鼠相比,db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗总共导致Amd1、Serpina1e、Sorbs3、Fabp4、Myl3、Upf2等109个蛋白的表达变化,涉及了糖酵解、脂肪酸氧化、ATP的合成及供能等生物过程及PPAR、支链氨基酸代谢等信号通路;中药复方益糖康可以改善db/db小鼠骨骼肌胰岛素抵抗,总共涉及了Pcolce、Pgk2、Trip11、Tmem41b、Mrps9、Bola2等49个蛋白的表达变化,通过调节三羧酸循环,乙醛酸和二羧酸代谢等通路实现;中药复方益糖康可以产生心血管受益,并能缓解由2型糖尿病及胰岛素抵抗导致的帕金森病、亨廷顿病。结论db/db小鼠是研究2型糖尿病及胰岛素抵抗的理想模型,TMT标记定量蛋白质组学技术可以精准发现相关差异蛋白,结果较权威;脾虚导致的骨骼肌线粒体功能障碍是2型糖尿病及胰岛素抵抗发病的原因之一;中药复方益糖康可以对2型糖尿病及胰岛素抵抗异常的生物过程起到纠正作用,与健脾修复线粒体损伤、促进线粒体自噬有关;整个实验过程筛选的差异蛋白及所涉及的生理病理变化是课题组下一步研究的重点。

基于串联质量标记的帕金森病血浆及血浆外泌体定量蛋白质组学分析

外泌体是一类可由各种细胞在生理和病理条件下释放的细胞外囊泡,其携带了多种生物活性分子,是疾病标志物的良好载体。目前,帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的诊断主要依靠临床表现,缺乏客观的疾病诊断标志物。因此,新型外周血特异性标志物的开发将有助于PD的早期筛查与诊疗。在本研究中,选取PD患者与正常对照人群的血浆及血浆外泌体作为研究对象,采用基于串联质量标记(tandem mass tag,TMT)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对其进行定量蛋白质组学分析,在血浆和血浆外泌体样品中分别定量到724和611个蛋白质。采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)对定量到的所有蛋白质进行生物学信息分析,以了解蛋白质的基因本体论(gene ontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集情况。根据细胞组分(cellular component,CC)分析,PD和正常对照组血浆样本中的差异表达蛋白质主要定位于细胞核中,血浆外泌体的差异表达蛋白质主要定位于细胞质中。与血浆差异表达蛋白质相关的分子功能(molecular function,MF)主要涉及RNA、DNA结合及补体结合等过程;而血浆外泌体差异表达蛋白质的分子功能主要表现为抗氧化作用、氧化还原酶活性调节作用等。由此可见,血浆外泌体中的差异表达蛋白质富集到的分子功能更具有疾病特异性。基于|log 2差异倍数(FC)|>0.26和统计学意义(P-value,P)<0.05,在PD血浆样本中共筛选出11个差异表达蛋白质,其中5个蛋白质表达上调,6个蛋白质表达下调;在血浆外泌体样本中,共筛选出13个差异表达蛋白质,其中6个蛋白质表达上调,7个蛋白质表达下调。本研究通过分析血浆及血浆外泌体样本的蛋白质组学信息来探究PD的发病机制,并通过比较发现,外泌体样本能够获得更多的差异表达蛋白质和生物学信息,为发现新型PD生物标志物和治疗靶点提供了新思路。

采用定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白

淋巴道转移是上皮来源恶性肿瘤转移的早期阶段,其发生机制不清,一直是肿瘤学研究面临的难题,为寻找淋巴道转移相关蛋白,以一对来源于同一亲本细胞,且淋巴道转移潜能显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株为研究对象,其中Hca-F为高淋巴道转移力细胞株,Hca-P为低淋巴道转移力细胞株,采用定量蛋白质组学技术——荧光差异双向凝胶电泳,建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞荧光差异蛋白表达图谱,高通量筛选与肿瘤淋巴道转移相关的蛋白质.经DeCyde软件分析,共得到163个有统计学差异的蛋白质点,选择2倍以上的差异性蛋白质点23个,经质谱鉴定得到17个蛋白质,在Hca-F中高表达的蛋白质有7个:转羟乙醛酶、波形蛋白、肌酸激酶(脑)、膜联蛋白7、膜联蛋白5、烯酰辅酶A水合酶1(过氧化物酶体)、核内异质核糖核蛋白A2/B1异构体1.而在Hca-F中低表达的蛋白质有10个:真核翻译延长因子2、Ero1样蛋白、乙醛脱氢酶2(线粒体)、苹果酸盐脱氢酶2(NAD)、β-内酰胺酶2、谷胱甘肽S转移酶"1、泛素C末端水解酶同工酶L3、内质网蛋白29(前体)、溶血磷脂酶1、微管不稳定蛋白.这些差异性蛋白质的功能涉及到代谢、蛋白质分泌、蛋白质结合、核苷酸结合,钙离子结合、凋亡和调节生长等过程.对这些蛋白质功能的进一步验证,将有助于解析肿瘤淋巴道转移的分子机制.

激光捕获显微切割技术结合^(18)O标记定量蛋白质组技术在胃癌标志物筛查中的应用研究

建立一种更加精确地分离鉴定胃癌特异肿瘤标志物的定量蛋白质组学技术.首先采用激光捕获显微切割技术(LCM)纯化胃腺癌细胞及胃黏膜良性上皮细胞,将裂解的样本总蛋白经过1DSDS-PAGE预分离,然后采用18O/16O分别标记两种样本酶切后的多肽混合物.结合纳升级液相色谱(Nano-HPLC-MS/MS)定量地鉴定胃癌细胞和胃黏膜良性上皮细胞的差异表达蛋白.共筛选出78个差异表达蛋白,其中42个蛋白质在胃癌组织中表达上调,36个蛋白质下调.Western blot技术验证了其中几个差异蛋白(moesin,periostin,annexin A2,annexin A4)的表达,与蛋白质组学研究的结果一致.LCM技术结合18O稳定同位素标记的定量蛋白质组学技术,为研究胃癌发生机制、筛选胃癌的分子标志物提供了新的思路,亦为诸如胃癌等复杂体系蛋白质的分离鉴定提供了新的技术选择.

^(18)O稳定同位素标记定量蛋白质组研究技术的建立与优化

建立了18O稳定同位素标记方法,用于复杂体系蛋白质相对定量分析。对影响蛋白质标记稳定性的实验条件进行了比较和优化。结果表明,采用酶切后标记的方法,酶切肽段在胰酶催化下,在pH 5.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲体系中,37℃18O标记反应16 h,绝大部分肽段即可达到100%的标记效率。对多个16O/18O成对肽段峰强度的动态范围及定量准确度进行了考察。结果表明,18O标记方法是一种简便、稳定、可靠的相对定量方法,10倍动态范围内,标记率相对标准偏差在18.4%以内,16O/18O峰强度呈很好的线性关系。本实验考察了标记后的肽段在不同溶液体系中的稳定性,为复杂样品的预处理和预分离的溶液条件提供了依据。

定量蛋白质组学揭示三角鲂和团头鲂响应嗜水气单胞菌侵染机制变化

细菌性败血症对鱼类危害严重,为探究鲂属鱼类不同抗性品种响应病原菌嗜水气单胞菌的抗性机制,以三角鲂(高抗)和团头鲂(易感)肝组织为材料,采用非标记定量蛋白质组学技术分析其在嗜水气单胞菌侵染胁迫后3、10和24h与对照组0h(未感染)肝组织蛋白质组的变化,对差异表达蛋白质进行质谱鉴定、相对定量和生物信息学分析。结果显示:三角鲂和团头鲂在嗜水气单胞菌侵染下,分别有46个和29个蛋白质在侵染后各时期的表达丰度相比对照都发生了显著变化。通过基因本体(gene ontology,GO)功能注释发现,相对于团头鲂,三角鲂中氧化还原蛋白质比例从7%增加到13%,且发现一类新的β-免疫球蛋白(β-globin)在各时期分别上调表达了1.64、3.44和1.93倍。生物信息学分析进一步表明,三角鲂在响应嗜水气单胞菌侵染过程中可能特异性地启动了包括戊糖磷酸途径、脂肪酸代谢、亮氨酸代谢途径和β-globin高表达的协同抗性机制,从而抵御病原菌入侵。该研究成果为后续深入揭示鱼病互作分子机制及鲂属鱼类抗病新品种选育提供了重要的前期理论研究基础。

硅介导番茄青枯病抗性的土壤定量蛋白质组学研究

番茄(Solanum lycopersicum)是一种重要的经济作物。由青枯菌(Ralstonia solanacearum)侵染所产生的青枯病是一种严重影响茄科类作物的细菌性土传病害。传统的防治方法,如培育抗性品种、轮作、药剂防治等均存在一定的局限。而硅作为一种作物生长的有益元素,在提高植物适应生物胁迫和非生物胁迫中均起重要作用。本研究以易感青枯病的番茄品种"台湾红圣女"作为试验材料,利用i TRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)定量蛋白质组学技术,研究硅和/或青枯菌接种对番茄青枯病抗性及土壤蛋白质组的影响。结果表明,2.0 mmol L-1硅处理能显著降低番茄青枯病的病情指数,增强抗病性。基于i TRAQ定量蛋白质组学技术,硅和/或青枯菌处理对土壤蛋白质组的研究表明,在鉴定的30个土壤蛋白质中,有29个蛋白差异表达显著(上调≥1.2倍,下调≤0.8倍差异)。青枯菌侵染诱发22个土壤蛋白下调表达,5个上调表达。在不接菌的条件下,硅处理有5个土壤蛋白上调,19个蛋白下调;而接菌条件下则有8个蛋白上调,14个蛋白下调。将这29个差异蛋白进行GO基因功能分类结果显示,硅和/或青枯菌处理主要影响生理代谢过程以及核酸结合蛋白。硅对番茄青枯病的作用机理主要体现在:改变微生物的代谢能力,调控与抗性代谢、蛋白质的合成与翻译、信号转导以及免疫系统过程和胁迫响应有关蛋白的表达,影响钙离子信号转导等。

基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记定量蛋白质组学方法的建立与优化

建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记,定量蛋白质组学研究方法,优化了影响标记效率的各种条件。在pH8.0的Na2B4O7/H3BO3缓冲体系中,当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量,22℃反应30 min时,标记即可完全。对多对H6/D6-乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察,并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点。结果表明:在10倍和30倍动态范围内,线性关系良好(r=0.99,r=0.98),理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%。

定量蛋白质组学中的同位素标记技术

定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定,并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定,是当前系统生物科学研究的重要内容。近年来,由于质谱技术和生物信息学的进步,定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就,但其最显著的成就应该归功于稳定同位素标记技术的应用。该技术使用针对某一类蛋白具有特异性的化学探针来标记目的蛋白质或肽段,同时化学探针要求含有用以精确定量的稳定同位素信号。在此基础上,实现了对表达的蛋白质差异和翻译后修饰的蛋白质差异进行精确定量分析。综述了在定量蛋白质组学中使用的各种同位素标记技术及其应用。

牛支原体iTRAQ定量蛋白质组学分析

为了解牛肺炎支原体临床分离菌株(HN12)与标准菌株(PG45)蛋白质差异表达情况,采用定量蛋白质组学研究策略,在牛支原体临床分离菌株(HN12)和标准菌株(PG45)的全蛋白质中进行差异蛋白质鉴定,并进行生物信息学分析。结果表明,共鉴定2402个蛋白质,其中存在显著差异的有66个。上调蛋白质数量为25个,下调蛋白质数量为41个。鉴定出的蛋白质主要有膜蛋白、跨膜蛋白、脂蛋白、延长因子、膜脂蛋白P81、伴侣蛋白、可变表面脂蛋白和ABC转运蛋白等。

基于定量蛋白质组学的棉花耐涝渍基因初步鉴定

应用iTRAQ标记结合LC-MS/MS分析的定量蛋白质组学技术,比较漂浮育苗及旱土育苗条件下棉花根系蛋白质表达差异,鉴定到169个差异表达蛋白,包括116个上调蛋白和53个下调蛋白。通过对差异表达蛋白的GO分析、COG功能注释分析以及Pathway代谢通路富集分析,发现12%的差异蛋白与棉花水分胁迫反应有关。研究还初步推测漂浮育苗棉花根系有氧呼吸受到抑制,无氧呼吸作用增强,Phosphoglucomutase、Dihydrolipoamide dehydrogenase和Alcohol dehydrogenase可能与棉花耐涝渍密切相关,其对应编码基因是棉花耐涝渍关键候选基因,值得进一步研究。

稳定同位素标签技术在定量蛋白质组研究的应用

高通量的从蛋白质组水平进行整体的蛋白质鉴定和精确定量比较分析,在阐述生物功能以及疾病发生发展机制等方面非常重要。稳定同位素标签技术在过去的几年中获得了很大的发展,并形成了代谢引入类、化学合成类以及酶解引入类等三大类型。该文对稳定同位素标签技术的技术特点以及应用进行了简述。

基于非标记定量蛋白质组学技术研究RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力

为从蛋白水平上探究ryhb对大肠杆菌酸性耐受力相关基因的影响,本研究采用非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株和△ryhb基因突变株进行蛋白质组学的差异性比较,并利用荧光定量PCR技术进行验证。本实验共检测到121个差异表达蛋白,其中44个蛋白的表达水平上调,19个蛋白的表达水平下调。为研究ryhb对表达蛋白的影响情况,并鉴定受其调控的相关基因,从上述差异蛋白中筛选出了hdea、hdeb、gada、gadb等与酸性耐受力相关的蛋白,并在基因水平进行验证。本研究表明,ryhb基因的缺失可能与上述4个耐酸基因转录水平上调相关,进而增强APEC耐酸性。本实验为初步探究ryhb调控通路,对APEC致病性影响提供了一定的实验依据。

定量蛋白质组学质谱采集技术进展

质谱是定量蛋白组学的主要工具。近年来随着定量蛋白质组学研究的深入,传统质谱定量技术面临着复杂基质干扰、分析通量限制等诸多问题。而最近一系列质谱新技术的发展,包括同步母离子选择(SPS)、质量亏损标记、平行反应监测(PRM)、多重累积(MSX)和多种全新数据非依赖性采集(DIA)等,为解决目前蛋白质组学在相对定量和绝对定量分析方面的局限提供了有效途径。本文对定量蛋白质组学目前遇到的瓶颈问题进行了分析,总结了质谱定量采集技术的最新进展,并评述了这些新技术的特点以及在定量蛋白质组学应用中的优势。

定量蛋白质组学分析方法

精确测量多个不同生理或病理条件下生物样本中蛋白质表达量的变化是定量蛋白质组学（quantitativeproteomics）研究的重要内容。与传统的蛋白质定量方法（见表1）相比，组学规模的蛋白质定量可以实现在一次实验中对成百上千个蛋白质的定量测定和比较分析，为规模化发现和验证疾病诊断的生物标志物以及发展新的药物靶标提供了重要手段。

稳定同位素化学标记结合质谱技术在定量蛋白质组学中的应用

传统的蛋白质组定量策略主要是通过双向凝胶电泳来进行相对定量。由于该方法不能对相对分子质量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离和检测,所以已不能适应目前蛋白质组研究深入发展的需要。近年来,定量蛋白质组学的发展主要是以同位素亲和标签试剂为代表的、以质谱检测为核心的稳定同位素化学标记方法。稳定同位素化学标记结合质谱技术,使定量蛋白质组的分析更趋简单、准确和快速,具有良好的发展前景。本文对稳定同位素化学标记结合质谱技术在定量蛋白质组学中的研究进展进行了评述。

定量蛋白质组学研究技术

随着蛋白质组研究的深入发展,人们已不满足对一个混合体系中蛋白质进行定性和简单定量分析,要求更加准确的定量分析。为此,有人提出了“定量蛋白质组学”概念。目前,应用于定量蛋白质学的研究技术主要有:蛋白质荧光染色技术、同位素标记技术、同位素亲和标签技术、蛋白质芯片技术。

基于定量蛋白质组学解析西瓜嫁接苗耐冷性的分子机制

目的与意义:西瓜是一种重要的喜温经济作物.低温是西瓜生产的主要环境限制因素之一.砧木嫁接是提高西瓜耐冷性的有效途径.然而,其分子机制知之甚少.本研究通过植株表型、光合作用及膜损伤程度等指标证实南瓜砧木嫁接提高了西瓜耐冷性,采用基于iTRAQ技术的蛋白质组学方法鉴定了低温处理2d后西瓜嫁接苗的蛋白质,分析了参与相关代谢途径的差异丰度蛋白,为从蛋白水平上揭示嫁接提高西瓜耐冷性的分子机制提供新的线索.

玉米种子萌发响应淹水胁迫的定量蛋白质组学研究

[目的]从蛋白质组水平上研究淹水胁迫对玉米种子萌发的影响,筛选重要蛋白质,阐明相关的代谢通路,为深入研究植物种子萌发过程中的耐淹机制提供新的思路。[方法]以玉米自交系196为试验材料,对种子萌发进行淹水胁迫72 h处理,利用TMT标记结合LC-MS/MS的定量蛋白质组学技术对蛋白质组成进行分析,对差异表达的蛋白质进行鉴定及功能分析。[结果]此次试验总共鉴定到1 456个蛋白,通过比较、筛选,鉴定到281个差异蛋白,其中244个上调蛋白,37个下调蛋白。通过对差异表达的蛋白质进行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,发现这些差异蛋白大多参与了碳代谢、糖酵解过程、氨基酸代谢、抗逆与胁迫等过程。[结论]试验表明淹水胁迫抑制了玉米种子的萌发,通过不同代谢类型的动态变化和不同的信号转导来提高种子耐受性。