实时定量逆转录PCR分析D-半乳糖致衰老小鼠胸腺相关基因表达的研究

目的建立D-半乳糖致衰老小鼠模型,分析其胸腺相关基因表达的研究。方法D-Gal模型组小鼠皮下注射剂量为500mg/kg·d的D-半乳糖溶液,连续注射8w;实时定量逆转录PCR方法对D-Gal模型组小鼠的几种胸腺状态和功能相关基因的表达进行相对定量以直接评价胸腺微环境。结果D-Gal模型组与对照组相比,胸腺相关基因表达变化比值为:LMO2:0.94±0.76,Foxn1:0.45±0.32,IL-7:0.69±0.7。结论D-Gal模型组与对照组相比,胸腺负调控因子的表达无明显变化,而胸腺微环境上皮细胞和胸腺细胞分泌及必需的因子的基因表达显著下降,因而在个体水平上,D-Gal破坏了胸腺微环境的稳定性和功能性,使小鼠胸腺发生明显退化。

db/db小鼠肝脏中实时定量逆转录PCR内参照基因及标准化方法的评估与整合（英文）

目的:实时定量逆转录PCR(RT-q PCR)结果的标准化对于保证最终结果的准确性尤其重要。常用的标准化方法包括用加入的核酸量校正(ΔCt法)、用单个内参照基因校正(ΔΔCt法)和用统计学软件计算多个内参照基因的几何平均值进行校正。我们在db/db小鼠肝脏中对各种校正方法进行评估。方法:用ge Norm和NormFinder两种软件评估ACTB、e IF5、GAPDH、HMBS、HPRT1、Polr2A和RPLP0共7个内参照基因,以肝脏脂质合成相关基因Thrsp、SCD、SREBP1c和FAS作为目的基因。结果:应用ΔCt法,db/db小鼠肝脏中所有目的基因及GAPDH的表达显著升高(P<0.05)。ge Norm计算认为ACTB和HMBS最稳定。Norm Finder计算认为ACTB最稳定,而GAPDH和RPLP0为最佳组合。以单个基因ACTB或RPLP0,以及ACTB与HMBS,或GAPDH与RPLP0的几何平均值进行校正,db/db小鼠肝脏中除SREBP1c以外,Thrsp、SCD1和FAS的表达均升高(P<0.05)。结论:用ΔCt法校正RTq PCR的结果稳定并具有生物学意义。统计学软件ge Norm或Norm Finder应与ΔCt法整合使用。

基于Ag85B mRNA的荧光定量逆转录PCR快速检测活结核分枝杆菌方法的建立和评价

目的建立评价荧光定量逆转录PCR快速检测活结核分枝杆菌的方法。方法建立检测Ag85B mRNA的荧光定量逆转录PCR方法,评价其特异性、灵敏度、重复性、区分细菌存活状态及检测临床样本的能力。结果该方法特异性强,仅扩增结核分枝杆菌。最低检出限是50 Copies/反应,菌落灵敏度为1.3×103cfu/ml,重复性好,可有效区分死菌和活菌。以培养法为"金标准",PCR法的灵敏度为100.00%,特异度为84.38%,符合率为93.15%,Kappa值为0.86。结论荧光定量逆转录PCR检测方法简便、快速、可靠,能有效区分结核分枝杆菌的存活状态,具有较高灵敏度和特异性,适用于临床样本的检测,为结核病的早期诊断、疗效评价及药敏情况分析提供了技术支持,有利于结核病的防控。

定量逆转录PCR检测丙肝病毒RNA

在反应体系中加入定量的突变型ＨＣＶ－ＲＮＡ模板进行竞争逆转录ＰＣＲ（ＣＲＴ－ＰＣＲ）可以定量测定标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ基因组拷贝数。ＣＲＴ－ＰＣＲ研究表明，随肝病进展，患者血清ＨＣＶ－ＲＮＡ复制水平持续增高；血清病毒含量高者对干扰素治疗反应差。

逆转录实时荧光定量PCR检测p73 mRNA在结肠癌的表达

目的:建立一种实时定量PCR方法检测p73mRNA的表达水平,探讨其与结肠癌发生、发展的可能关系。方法:采用SYBRGreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR检测39例结肠癌组织和其癌旁组织中p73mRNA的表达。结果:p73基因在结肠癌肿瘤组织的表达水平高于其在癌旁组织的表达(P<0.01);表达水平与肿瘤的恶性程度、分化及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:p73的高表达可能与结肠癌的发生、发展及预后有联系。

逆转录-实时定量PCR检测CEA基因的表达在乳腺癌诊断中的应用

目的通过检测乳腺癌病人外周血和乳房肿块细针穿刺中肿瘤细胞的CEAmRNA拷贝数对乳腺癌的进行诊断并对血行转移进行监测。方法采用逆转录-实时定量PCR技术检测61例正常人外周血和58例乳房肿块病人(其中38例乳腺癌病人,15例良性小叶增生,5例乳腺纤维腺瘤)外周血、乳房肿块穿刺标本及肿瘤组织中的CEAmRNA拷贝数。结果61例正常人外周血中均无CEAmRNA的表达。乳腺癌病人的乳房肿块穿刺标本中CEA表达为89.5%,CEAmRNA拷贝数在106～107/ml;38例乳腺癌病人外周血中的表达阳性率为52.7%,浓度范围为102～104拷贝/ml;癌组织中CEA表达为100%,CEAmRNA拷贝数在104～107/mg;20例良性乳房肿块病人外周血及细针穿刺标本中均无CEAmRNA的表达。结论采用逆转录-实时定量PCR技术能特异、灵敏地诊断乳腺癌,并通过检测病人外周血中CEAmRNA来了解病人体内微转移的情况。

直接从家禽排泄物中检测和定量空肠弯曲杆菌的逆转录定量PCR方法研究

弯曲杆菌属是导致人类细菌性腹泻的主要原因,亟需一种快速而可靠地检测和定量该病原的方法。本研究建立了运用逆转录荧光定量PCR直接从鸡粪便中检测和定量空肠弯曲杆菌的方法,并将其与另一种基于DNA的荧光定量PCR方法和细菌培养方法进行比较。运用细菌培养和逆转录荧光定量PCR方法,可在5d后从人工或天然污染的粪便样品中检测到空肠弯曲杆菌。在使用细菌培养方法无法计数细胞时,逆转录荧光定量PCR亦无法检测到阳性扩增信号,而运用基于DNA的荧光定量PCR方法可以检测到死亡的或无法培养的弯曲杆菌细胞,即使在经过20d保存处理后所有被检测样品仍是阳性。这种直接从鸡粪便样品中检测和定量空肠弯曲杆菌的方法在检测环境弯曲杆菌中的应用还有待进一步研究。

犬细小病毒感染F81细胞microRNA荧光定量PCR内参基因的筛选

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是犬急性胃肠炎的主要病原之一,对犬类的健康造成极大危害。MicroRNA(miRNA)是小的、非编码的RNA,在转录后水平调节基因表达。荧光定量PCR(RT-qPCR)是评估miRNA表达水平最常用的方法,而合适的参考基因在RT-qPCR数据归一化中起着至关重要的作用。本研究在分析F81细胞空白对照组和感染CPV组小RNA高通量测序结果基础上,结合参考文献,在CPV感染后12 h和24 h,通过poly(A)延伸RT-qPCR定量方法检测候选内参基因小RNA的表达情况,并使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper算法评估这些候选小RNA的稳定性。结果选取了5种高通量测序中表达相对稳定的miRNAs(dno-miR-186-5p、pha-miR-152、dno-miR-374a-5p、tch-miR-26a-2-5p和oga-miR-26b)和常用作参考基因的小核RNA U6(RNU6-1)、核仁小RNA(small nucleolar RNA)SNORD95以及SNORD96a,经过扩增分析及对高通量测序中差异表达的dno-miR-7-5p的定量验证发现,这些候选小RNA均具有较好的稳定性。其中pha-miR-152在检测样品中稳定性最好,可在CPV感染F81细胞中作为RT-qPCR法定量miRNA表达及数据均一化的合适参考基因。筛选出的pha-miR-152有助于研究miRNAs在CPV感染过程中的定量表达分析,为进一步研究F81细胞中miRNA调控CPV感染复制的分子机制研究提供可靠手段,也为其他相关物种miRNA定量研究中内参基因的选择提供参考。

葡萄浆果内坏死病毒RT-q PCR检测技术建立及其在葡萄砧木中的时空分布规律

【背景】葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)是近年来在中国报道的一种正单链RNA病毒,该病毒发生普遍且危害严重。高灵敏的检测技术是病毒田间监测和无病毒苗木培育的关键。【目的】建立灵敏度较高的GINV逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测体系;明确不同葡萄砧木对GINV的敏感性;明确GINV在寄主植株中的时空分布规律,为该病毒的监测预警提供技术支撑。【方法】根据GenBank已登录GINV的复制酶(replicase,RP)、移动蛋白(movement protein,MP)和外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列设计6套引物,通过常规RT-PCR和RT-qPCR筛选特异性强、扩增效果好的引物。再通过对退火温度和引物浓度等反应条件的优化建立GINV的SYBR Green I染料法RT-qPCR检测体系,并进一步对该技术的灵敏度、特异性和田间适用性进行评价。将GINV接种到贝达、SO4、101-14、140R和1103P 5种葡萄砧木上进行症状观察和病毒检测,以筛选GINV敏感性较高的指示植物。基于所建立的RT-qPCR技术对接种GINV葡萄砧木的不同生长时期、不同部位样品进行GINV检测,从而明确GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。【结果】建立了GINV SYBR Green I染料法RT-qPCR检测技术体系,其最佳引物为GINVRPYGF2/R2,最佳引物浓度为300 nmol·L^(-1),最佳退火温度为58.4℃。该技术对GINV的检测特异性强,其检测灵敏度达常规RT-PCR的1 000倍。症状观察结果表明贝达感染GINV的症状最为严重,表现为叶片系统性坏死,而其他砧木叶片仅表现褪绿斑驳和环斑症状。RT-qPCR检测结果表明GINV在EL27时期(坐果期)的相对含量最高,5个品种间的病毒相对含量在EL12(花序分明期)和EL27时期间无显著差异,EL31时期(果实增大期)的贝达与SO4、101-14、140R和1103P的病毒相对含量存在显著差异;GINV的相对含量在不同组织部位存在较大差异,由高到低依次为下部叶片、上部叶片、上部茎秆、下部茎秆、根部。【结论】建立了灵敏度高、特异性强的GINV RT-qPCR检测方法,利用该方法明确了GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。

利用实时荧光定量RT-PCR检测鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达

依据鸡A-FABP和H-FABP基因及参照基因GAPDH序列设计引物,以鸡心肌、胸肌和腿肌、肝脏和腹脂总RNA逆转录合成的cDNA为模板,GAPDH基因为参照基因,应用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测如皋黄鸡和安卡红鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达。结果表明:A-FABP、H-FABP基因和参照基因GAPDH基因融解曲线为单峰,无杂峰及二聚体,其扩增效率分别为99.7%、99.8%和100.0%。如皋黄鸡H-FABP基因在心肌、胸肌和腿肌的差异表达量分别是安卡红鸡的0.0860、0.0680倍和0.0580倍(P<0.05)。H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪含量呈显著负相关。如皋黄鸡A-FABP基因在腹脂和肝脏的表达量分别是安卡红鸡的15.9640倍和10.9640倍(P<0.05),而在心肌、胸肌和腿肌的表达量差异不显著。

运用实时荧光定量RT-PCR和ELISA方法定量检测SHIV的对比分析

目的 建立一种实时、灵敏、特异的针对人／猴免疫缺陷病毒（SHIV）的RNA载量检测方法，通过与酶联免疫吸附试验（ELISA）进行比较，成为监测SHIV病毒体外复制过程的常用方法。方法 体外转录制备RNA标准品，利用TaqMan EZ逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）试剂盒的反应体系和针对SHIVgag保守区91个碱基的Taq—Man探针与引物，建立一步法实时荧光定量RT—PCR。三种SHIV感染性分子克隆体外转染293T细胞，在不同的时间点采样，通过实时荧光定量RT—PCR和ELISA两种方法监测SHIV病毒复制过程。结果两种方法监测的病毒复制过程基本一致，转染后2～48小时病毒复制出现明显的对数生长期，之后进入平台期，p24浓度大约100pg／ml，而RNA载量大约在100拷贝／ml。两者具有很好的相关性（r^2=0．834；P〈0．001）。实时荧光定量RT＋PCR灵敏度更高，检测范围更广，费用更低。结论 所建立的一步法检测SHIV病毒载量的实时荧光定量RT—PCR方法，可以作为监测SHIV体外扩增的常用方法。

荧光定量PCR检测大肠癌患者CEA mRNA表达的研究

目的 通过检测大肠癌病人外周血清中癌胚抗原（CEA）,外周血及淋巴结中癌胚抗原信使核糖核酸（CEA mRNA）的相对表达量,建立外周血中定量检测CEA mRNA的方法,并探讨CEA mRNA检测在结直肠癌诊断中的临床意义.方法 采用逆转录-荧光定量PCR技术检测大肠癌病人外周血及淋巴结中CEA mRNA的相对表达量,并用电化学发光法检测外周血中的CEA.结果 50例大肠癌患者手术前外周血CEA mRNA表达阳性率为84%,与正常对照组（20人无1例阳性）比较,差异有统计学意义（P＜0.01）;CEA 阳性率为22%与CEA mRNA表达阳性率相比两者差异有统计学意义（P＜0.01）.淋巴结CEA mRNA表达阳性率32.3%,与外周血中CEA mRNA表达阳性率相比两者差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 建立了SYBRGREEN 荧光定量PCR检测大肠癌患者CEA mRNA表达的方法,大肠癌患者手术前外周血CEA mRNA表达阳性率较高,且显著高于外周血中CEA含量以及淋巴结中CEA mRNA表达阳性率,可用于大肠癌患者的术前诊断.

偏肺病毒逆转录实时荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立偏肺病毒逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）,并检测临床样本,了解偏肺病毒感染患儿的临床流行病学特点.方法 针对保守基因F合成引物和探针,制备偏肺病毒转录RNA标准品并建立标准曲线,检测线性范围、最低检测限、重复性、灵敏度和特异性.对采集自2010年12月至2011年11月兰州地区急性呼吸道疾病患儿的222份下呼吸道临床标本进行偏肺病毒筛查,同时对阳性标本进行常见呼吸道病毒的共感染筛查,并对偏肺病毒进行相关流行病学分析.结果 方法线性检测范围是10-108拷贝/μl,最低检测限是10拷贝/μl,曲线相关系数是1,扩增效率是91.62％,Ct值组内CV值小于2％.以传统PCR产物的测序结果为参照,逆转录实时荧光定量PCR的敏感性和特异性分别是100％和96.17％.偏肺病毒检出22例（9.46％）,其中男童13例（5.86％）,女童8例（3.60％）.春、夏、秋、冬的检出率分别是15.71％、0％、5.08％、11.11％.偏肺病毒载量与混合感染、疾病种类、临床症状差异均无统计学意义.结论 该方法是检测偏肺病毒灵敏度、特异性和重复性均较好的方法;偏肺病毒在兰州地区儿童呼吸道感染中占有重要地位,长期系统的监测具有重要意义.

三七总甙对NB4细胞核转录因子-κB及组织因子表达的影响

目的 通过核转录因子NFκB及其抑制因子IκB的表达探讨三七总甙 (PanaxnotoginsengsaponinsPNS)对NB4细胞组织因子的调控机制。方法 用三七总甙处理NB4细胞 ,分别于处理后 2 4h、4 8h、72h、96h、12 0h收获细胞 ,半定量逆转录PCR检测TF mRNA的表达 ;Western蛋白印迹检测细胞内NFκB的亚单位 p6 5及IκBα的蛋白 ,以及核蛋白p6 5的表达。 结果 三七总甙处理NB4细胞 2 4h ,TF mRNA表达开始下降 ,12 0h完全抑制。Westernblot显示三七总甙抑制细胞内IκBα及核蛋白 p6 5的表达。结论 三七总甙抑制组织因子的表达 ,可能是通过抑制NFκB的活化起作用。

RNA逆转录荧光定量PCR检测食源性沙门菌

目的:针对活的沙门菌,建立快速检测的方法。方法:以沙门菌OmpC基因RNA为检测对象,针对其设计荧光定量PCR引物和探针,摸索合适的反应体系和反应条件,同时以沙门菌及其亲缘关系较近的对照菌株进行特异性实验,以PCR产物克隆质粒和沙门菌纯培养物梯度稀释进行灵敏度实验,最终建立食源性沙门菌快速检测逆转录实时荧光PCR方法。结果:所设计的S-F/S-R引物和S-Probe探针能有效地将沙门菌与其他亲缘关系较近的肠杆菌科细菌如金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、志贺菌等区分开来。该方法对沙门菌纯培养物梯度稀释后的检测下限为<10 CFU/25 ml。同时,将建立的RNA逆转录荧光定量PCR检测方法与DNA荧光定量检测方法进行比较,DNA荧光定量PCR灵敏度仅为103 CFU/ml,远低于逆转录荧光定量PCR,且逆转录荧光定量PCR针对RNA进行检测,与活的沙门菌相关联,准确度更高。结论:建立沙门菌逆转录荧光定量PCR检测技术,具有特异、灵敏、快捷的特点,适用于食品中沙门菌的快速检测。

胃肠道恶性肿瘤t-PA、u-PA转录的临床研究

目的 :研究胃肠道恶性肿瘤患者纤溶分子标志物血浆含量、mRNA水平的变化 ,初步探讨两者与肿瘤浸润、播散的关系及其临床检测意义。方法 :采用逆转录、实时定量PCR技术检测 2 3例胃癌、17例肠癌患者组织中组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)、尿激酶型纤溶酶原激活剂 (u PA)mRNA水平 ;用ELISA法同步检测患者血浆纤溶分子标志物含量 ,包括t PA、u PA、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体 (u PAR)、纤溶酶 抗纤溶酶复合物 (PAP)等。结果 :胃癌、肠癌组患者血浆u PA、u PAR、PAP蛋白含量均较正常对照明显升高 ,其中 ,有局部浸润、淋巴结转移、远处脏器转移者u PA升高更为显著 ;t PA含量与正常对照无显著差异。u PAmRNA在两种肿瘤细胞表达均显著增高 ,而t PAmRNA则减少。结论 :纤溶功能亢进是胃肠道恶性肿瘤细胞易播散、浸润的主要原因之一。t

运用FQ-RT-PCR研究鼠结肠AQP8的表达

目的:通过设计特异引物和探针,运用荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法研究小鼠结肠AQP 8表达。方法:应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法。结果:数值可以发现降结肠高于升、横结肠,但通过方差分析结肠各部位间AQP 8mRNA表达量的差别无统计学意义(P>0.05)。结论:荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)具有特异性强、灵敏度高、定量准确性高等优点;小鼠结肠均有AQP 8表达。

肝癌组织HNF4αmRNA定量检测方法的建立与初步应用

目的建立一种定量检测肝细胞癌(HCC)组织肝细胞核因子4α(HNF4α)m RNA的方法。方法取手术获得的HCC组织16例,提取总RNA,逆转录PCR扩增获得全长HNF4αm RNA对应c DNA产物,经TA克隆后,测序确认。根据获得序列,设计检测HNF4αm RNA引物及MGB荧光探针。以体外转录HNF4αm RNA为标准品,建立一步法逆转录荧光定量PCR检测方法,同时设定β-actin m RNA为内参对照,最终计算得到组织HNF4αm RNA水平。采用免疫组化染色检测HNF4α蛋白表达,比较HNF4αm RNA水平与HNF4α蛋白表达的对应结果。结果 HCC组织HNF4αm RNA定量标准曲线斜率为-3.237,相关系数r值达0.994,β-actin m RNA定量标准曲线斜率为-3.037,相关系数r值为0.996,表明建立的方法可用于检测HNF4αm RNA定量(V-4α值),16例HCC组织HNF4αm RNA与HNF4α蛋白表达结果呈一致性对应关系。结论我们初步成功建立了定量检测HCC组织HNF4αm RNA水平方法,其意义还需要进一步研究。

慢性丙型肝炎患者肝左右叶丙型肝炎病毒RNA的定量分析

肝脏是丙型肝炎病毒（HCV）攻击的靶器官,但对肝组织的HCV RNA水平及其分布仍知之甚少。测定肝组织的HCV RNA水平对研究与HCV有关的肝病的自然史、发病机理、病情进展和治疗可能有益。本文作者研究的目的:1.测定左、右叶肝组织的HCV RNA水平;2.评价血清与肝组织的HCV RNA水平之间的相互关系;3.研究血清和肝组织的HCV RNA水平与慢性丙型肝炎患者的肝组织病变严重程度的关系。 慢性丙型肝炎患者18例,男性14例,女性4例。年龄28～70岁,平均42岁。血清ALT异常达6个月以上,经重组免疫印迹法(RIBATM,2.0,Chiron corp)