实时定量聚合酶链反应的研究及应用(综述)

实时定量聚合酶链反应(real-timequantitativePCR,RQ-PCR)是综合PCR、分子杂交和酶动力学的一种新技术,它根据荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytranslation,FRET)的原理进行.目前已经成功地开发出TaqManTM、molecularbeaconprobe、amplifluortechnologies、LightCycler和single-labeledprobe几种相关的技术,并广泛地应用于病毒学、遗传性疾病和肿瘤等方面的诊断检测.实验研究表明:RQ-PCR作为一种快速、准确的核酸检测方法,在临床及生物学研究方面均具有相当的实用价值.

实时定量聚合酶链反应与巢式聚合酶链反应在289例白血病融合基因检测中的比较

目的比较实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)与巢式聚合酶链反应(nPCR)在白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO检测中的结果。方法分别应用RT-PCR与nPCR对289例急慢性白血病初诊和完全缓解的患者BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO融合基因进行检测,结合患者骨髓细胞形态学及临床转归予以分析。结果 46例初诊慢性粒细胞白血病(CML)患者中,RT-PCR与nPCR检测BCR/ABL融合基因阳性率分别为95.7%和93.5%(P=0.997);69例完全缓解CML患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为78.4%和58.1%(P<0.05)。32例初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者中,RT-PCR与nPCR检测PML/RARa融合基因阳性率分别为93.8%和90.6%(P=0.996);114例完全缓解APL患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为12.3%和7.0%(P<0.05)。12例初诊急性粒细胞白血病M2(ANLL-M2)患者中,RT-PCR与nPCR检测AML1/ETO融合基因阳性率分别为50.0%和50.0%(P=1.0);16例完全缓解ANLL-M2患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为50.0%和12.5%(P<0.05)。结论 RT-PCR较nPCR更为敏感而准确,应用RT-PCR可以提高微小残留病的检出率,为临床诊断和治疗提供更为有效的分子生物学依据。

变性温度和时间对实时定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响

背景:在实时荧光定量聚合酶链反应检测过程中,由于设计的热循环参数不同,检测结果常会出现假阳性或假阴性。目的:变性温度、变性时间以及聚合酶链反应运行的温度特性对实时荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响。设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-07-06/08在上海市安图医院PCR实验室完成。材料:LightCycler荧光聚合酶链反应检测仪由美国罗氏公司提供,乙型肝炎病毒核酸扩增聚合酶连反应荧光定量检测试剂盒由深圳匹基公司提供。方法:聚合酶链反应运行程序条件:变性温度分别为88～97℃,变性时间分别为5s和40s,退火和延伸60℃,40s,循环数40。主要观察指标:乙肝病毒遗传物质的数量。结果:聚合酶链反应运行温度上冲和下冲比较严重;变性时间对DNA浓度较低的样本影响很大,DNA很难被检测出;变性温度超过95℃,变性时间超过40s时,检测到的DNA的量明显降低;变性时间小于20s时,容易出现假阴性。结论:变性时间太短、变性温度太高且变性时间太长容易造成乙型肝炎病毒检测出假阴性。

实时定量聚合酶链反应检测巨细胞病毒在同种异基因造血干细胞移植术后监测中的意义

目的:探讨同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)激活情况及激活相关因素。方法:52例接受allo-HSCT的患者为研究对象,所有患者及其供者移植前均为CMV携带者,即为CMV血清型阳性。所有移植术后患者应用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法对CMVDNA进行定量检测。结果:移植后100d内,52例患者中28例检测到CMVDNA复制。造血干细胞移植(HSCT)供者类型和移植物抗宿主反应(graft versus host disease,GVHD)的发生与CMV激活明显相关(P值分别为0.018和0.039)。在44例可评估患者中,allo-HSCT100d后仅7例检测到CMVDNA复制,其发生率与移植后发生GVHD且接受激素治疗(P=0.0009)、人类白细胞抗原(HLA)全相合无关供者移植或者HLA部分相合同胞供者移植有关(P=0.037)。应用实时定量PCR检测发现,CMV对更昔洛韦抢先治疗的应答存在2种动力学模式(快速型和缓慢型),其中表现为缓慢型的患者CMV最高负载量较快速型高10倍以上,其病毒衰减时间也要延长3～4周,多数发生在因出现GVHD而接受激素治疗以及接受HLA全相合无关供者和HLA部分相合同胞供者干细胞移植的患者。结论:移植前CMV血清型阳性患者接受allo-HSCT后100d内出现CMV激活是常见并发症。移植100d之后,对于未发生GVHD而未使用激素治疗者或以HLA全相合同胞为供体的患者,CMV激活概率低,无需进行常规频繁监测。

实时定量聚合酶链反应检测在恶性血液系统疾病患者侵袭性真菌感染早期诊断中应用价值

侵袭性真菌感染是指真菌引起的感染,常见为侵袭性肺部真菌感染。真菌对气管支气管和肺部的侵犯,引起气道黏膜炎症和肺部炎症肉芽肿,严重者引起坏死性肺炎,甚至血行播散到其他部位。研究表明,免疫力较弱的患者无法抵挡侵袭性直菌感染(IFIs)的袭击,深受折磨,且该疾病易被原发病掩盖[1],早期诊断在临床医疗上有非凡的意义。既往表明干细胞或器官移植患者IFIs发病率最高,随着各种药物在治疗中的普遍使用,产生了类似优胜劣汰的作用,烟曲霉菌在感染中的致病作用呈上升趋势[2]。实时定量聚合酶链反应(PCR)检测的敏感性及特异性比一般的临床检测要高出很多,并克服了许多现有检测方法的不足。在本次研究中,PCR检测结合半乳糖甘露聚糖检测,对比分析评价其诊断疗效,为快速的诊断试剂提供了理论数据,具有很高的医学价值和应用前景。现报告如下。

实时定量聚合酶链反应检测心血管活性多肽apelin方法的建立

目的 :建立实时定量聚合酶链反应 (RQ PCR)检测心血管活性多肽的方法 ,为快速、准确地分析心脏组织中apelin基因表达奠定基础。方法 :根据心血管活性多肽apelin基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记TaqMan探针。将逆转录 聚合酶链式反应扩增的apelin基因片段克隆至pGEM Teasy载体 ,重组质粒经蓝白筛选、酶切、测序鉴定后 ,作为阳性克隆标准品 ,用于标准曲线的制定 ,由此可定量检测出每一样品模板的起始拷贝数。结果 :阳性克隆标准品制作的标准曲线可显示循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系 (r =0 970 ) ,可用于apelin基因表达的起始拷贝数定量测定。结论 :RQ PCR方法较常规PCR技术更为简便、准确、特异、灵敏 。

实时定量聚合酶链反应在肾移植后人巨细胞病毒活动性感染的临床应用研究

目的:建立血浆、外周血白细胞HCMV DNA实时定量聚合酶链反应检测方法,评价其监测肾移植后人巨细胞病毒活动性感染的临床应用价值。方法:用重组质粒PQHY-1制作标准曲线;分别用实时定量聚合酶链反应和免疫组织化学方法,对28例肾移植术后病人采血标本动态检测,并将结果进行比较。结果:实时定量PCR最低可检测出20拷贝/孔的HCMV DNA,且可重复性强(批内及批间误差均<5％),在102～107拷贝/孔的浓度范围时与Q值有很好的线性关系(r=-0.978)。与PP65抗原血症检测结果比较,血浆及外周血白细胞定时定量检测的灵敏度分别为88.5％,94.2％;特异度分别为97.8％,95.4％。HCMV活动性感染时血浆和外周血白细胞HCMV DNA平均含量分别为102.4拷ml和103.2拷贝/106PBL。血浆和外周血白细胞中HCMV DNA阳性检出时间较PP65抗原血症阳性检出时间平均要早1.6和3.8天。结论:实时定量聚合酶链反应检测方法是一种灵敏度高,特异度好的定量检测方法,可用于监测早期HCMV活动性感染。

实时定量聚合酶链反应动态监测白血病治疗后微小残留病研究

目的建立急性早幼粒细胞白血病(APL)实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测方法,并检测APL治疗后微小残留病(MRD),评价MRD检测的意义。方法应用RQ-PCR对96例APL患者的骨髓标本进行分析,检测PML/RARa融合基因的转录水平。结果 (1)RQ-PCR与传统巢式PCR(RT-PCR)检测结果的差异有统计学意义(P<0.05),提示应用RQ-PCR检测PML/RARa融合基因转录水平的敏感性高于RT-PCR。(2)RQ-PCR可对PML/RARa融合基因进行定量检测,监测患者的PML-RARa融合基因拷贝数水平变化,结果显示初诊时较高,有效治疗后迅速下降,复发时又出现上升,提示若患者在完全缓解(CR)后PML/RARa融合基因拷贝数呈现上升趋势,其复发机率大。结论 RQ-PCR检测作为APL治疗后微小残留病检测的方法,准确可靠,可以判断治疗效果,预测疾病复发,早期给予干预治疗,有重要的临床应用价值。

实时定量聚合酶链反应结合Taqman荧光探针JCV-P检测肾移植受者JC病毒

目的：建立肾移植受者尿液和外周血JC病毒（JCV）感染实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测方法。方法针对JCV基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R ，Taqman荧光探针JCV-P ，探针的5′端标记有荧光基团，在除5′端外的任意一个位置上标记有淬灭基团；然后处理待测样本，进行PCR反应，建立重组质粒标准曲线，评价特异性、灵敏度、重复性。结果将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST 比对后证实JC V基因序列；利用上述方法对86份样本进行检测：20份JC V血清样本及20份JC V尿液样本检测均为阳性，有S型扩增曲线，动态范围测定显示103～1010拷贝/m L标准曲线具有良好的相关性；20份健康人尿液样本和20份血液样本及6份临床常见的其他病原体血液样本检测均为阴性，无S型扩增曲线。结论实时荧光定量PCR结合Taqman荧光探针JCV-P检测肾移植术后患者JCV方法可用于肾移植术后JCV感染的的早期诊断，对预防JCV感染造成的多瘤病毒相关性肾病（PVAN）和进行性多灶性脑白质病（PML）具有一定意义。

实时定量聚合酶链反应在肺结核早期诊断中的价值

目的探讨实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）在肺结核早期诊断中的价值及对结核分枝杆菌检出率较抗酸染色的优势。方法收集2015年7～8月疑似结核患者痰液标本191份,分别采用RQ-PCR和抗酸染色检测标本中结核分枝杆菌并进行比较。结果 RQ-PCR检测阳性率[27.75%（53/191）]显著高于抗酸染色[9.95%（19/191）],差异有统计学意义（χ^2=1.43,P〈0.01）;RQ-PCR检测灵敏度、约登指数较抗酸染色高,抗酸染色检测特异性较RQ-PCR高,综合各项指标以RQ-PCR较好。结论 RQ-PCR对结核分枝杆菌的检测具有高特异性、灵敏度及快速、简便等特点,在肺结核早期诊断中具有很好的参考价值,可作为诊断肺结核的常规方法,适合在临床推广应用。

实时定量聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3方法的建立

目的建立检测前列腺癌抗原3（PCA3）基因的实时定量聚合酶链反应（PCR）方法。方法应用反转录一PCR扩增PCA3后，通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行鉴定。应用SYBRGreen实时荧光定量PCR检测PCA3和建立相应的标准曲线，使用熔解曲线分析扩增产物的特异性。同时在临床标本中验证所建立的PCA3检测方法的效能。结果琼脂糖凝胶电泳和基因测序均提示扩增产物是特异性的。建立的检测PCA3的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法的线性检测范围为1×10^1～1×10^-7拷贝，扩增效率为98％，决定系数为0．999。熔解曲线仅见单一的峰，证实扩增产物是特异性的。该方法的日内和日间变异系数分别为2．1％和2．7％。利用所建立的PCA3检测方法分析86例前列腺癌患者和45例非前列腺癌患者尿液中的PCA3表达水平，结果表明PCA3早期诊断前列腺癌的性能显著优于血清前列腺特异性抗原（PSA）。结论建立了一种快速、灵敏、高特异性、宽定量范围和高重复性检测PCA3的实时定量PCR方法。

实时定量聚合酶链反应检测人半翼基因在宫颈病变中的表达及意义

目的探讨人半翼(hWAPL)基因在宫颈病变,包括慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(CIN)和宫颈癌组织中的表达及意义。方法用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测100例宫颈病变组织,包括慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组织各20例中hWAPL基因mRNA表达量,并经β-actin基因校正得到hWAPL基因mRNA相对表达量。结果慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈癌组hWAPL基因mRNA相对表达量逐渐升高,分别为(1.05±0.68)、(3.05±1.57)、(4.48±2.25)、(8.71±7.70)和(10.49±9.82)。宫颈癌组和CINⅢ组与慢性宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组3组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);宫颈癌组与CINⅢ组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 hWAPL基因在宫颈组织,包括慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组织中均有表达。随着宫颈病变程度的加重hWAPL基因的表达量逐渐增加,在CINⅢ组和宫颈癌组中表达量明显高于慢性宫颈炎组、CINⅠ组和CINⅡ组。hWAPL基因的高表达可能在宫颈癌的发生中起重要作用。

实时定量聚合酶链反应在t(8;21)急性髓系白血病移植中的应用

选取我院28例t(8;21)急性髓系白血病(AML)高危患者为研究对象,移植后依据实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)技术监测微小残留病(MRD)动态变化,制定干预及治疗方案。移植后MRD转阴与MRD持续阳性患者的血液学复发率分别为10.5%和77.8%,提示RQ-PCR技术在t(8;21)AML患者移植中有重要指导意义。

实时定量聚合酶链反应诊断感染性后部葡萄膜炎

目的：证实实时聚合酶链反应(PCR)分析可快速敏感地检测和定量感染性后部葡萄膜炎的4种常见病原体。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

火鸡源性成分实时聚合酶链式反应检测方法ISO标准研制

选择火鸡染色体Z DNA序列的特异片段作为检测靶序列,建立了实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,该方法种间特异性和种内一致性良好。将靶序列克隆到pUC57质粒中,通过对不同稀释浓度的质粒样品进行real-time PCR测试,该方法绝对检测限为5拷贝/PCR反应。组织国际协同实验对方法进行验证,方法的假阳性率、假阴性率均为0%,绝对检测限为5拷贝/PCR反应。根据对各实验室不同稀释浓度的质粒样品的定性测试结果对方法进行分析,结果表明,实验室间标准偏差为0.30,低于最大允许值1;在检出概率为95%的情况下,方法的绝对检测限为3.2拷贝/PCR反应,低于最大允许值20拷贝/PCR反应。将该方法提交国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO),经过标准不同的制订阶段投票、征求意见,正式上升为ISO标准(ISO/TS20224-8:2022)。