SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。

利用可视基因膜芯片技术与实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析肉制品中动物源性成分

为调查了解肉制品中动物源性成分,以帮助判别掺假情况,应用可视基因膜芯片检测技术对市售的肉松、香肠、肉卷、预制调理肉、肉干及肉脯等23份样品动物源性成分进行筛查分析,同时,针对筛查结果采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法进一步确证。结果表明:可视基因膜芯片检测法与实时荧光定量PCR法检测结果一致,提高了未知样品的筛查效率;在本次随机分析的样品中,动物源性成分检测结果与标签标示不一致的情况占比高达21.7%,肉制品掺假虚标情况不容忽视。

实时荧光聚合酶链式反应检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系

目的:建立实时荧光聚合酶链式反应检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系的鉴定方法。方法:以转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2为研究对象,在转基因小麦外源片段与小麦染色体重组的边界序列分别设计引物和探针,以其他多种转基因产品和非转基因小麦为对照进行特异性实验,以B73-6-1样品模拟制备10个含量梯度的添加样品进行灵敏度实验。结果:本研究设计的引物和探针具有很好的品系鉴定特异性,检测灵敏度可达到0.01%(m/m)。结论:该方法特异性好、灵敏度高,可快速、准确地鉴定转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的 探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法 建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 + 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果 优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论 为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。

检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应方法的建立

以鲜切叶菜中的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)为研究对象,建立定量检测E.acetylicum的双重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法。以前期试验发掘到的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)的特异性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特异性基因oxi_50582462为检测靶点,对其设计特异性探针,并对反应体系进行优化,以12株E.acetylicum为阳性对照,以4株微小杆菌属内其他种的菌株以及10株非微小杆菌的腐败菌/致病菌作为阴性对照,对建立的RT-PCR进行特异性检测;通过标准曲线的制备、灵敏度、可重复性来评价该方法的有效性。最后,应用该RT-PCR方法对不同贮藏日期鲜切叶菜中的E.acetylicum进行检测。结果表明:本研究设计的探针特异性良好;检测靶点P401_RS0117025与oxi_50582462的标准曲线的R2值分别为0.994和0.999,且重复性好;该方法的DNA检测限为1.629×10^(-7)ng/μL,纯菌菌落检测限为3.4 CFU/m L,并能对鲜切叶菜中的E.acetylicum进行灵敏检测。此外,还建立了"Ct(阈值)-Nt(菌体浓度)"的数量关系,能对供试样品中的E.acetylicum进行绝对定量。总之,本研究建立了准确、灵敏、高效检测食品中腐败菌E.acetylicum的RT-PCR定量方法,为食品货架期预测提供了理论依据。

荧光定量聚合酶链式反应种植前胚胎β-地中海贫血基因诊断

目的 用荧光定量聚合酶链式反应 (PCR)方法进行种植前β-地中海贫血一种中国人常见突变类型 CD4 1/ 4 2 (- TCTT)的基因诊断。 方法 来源于β-地中海贫血病人或携带者的 2 89个淋巴细胞和人体外受精 -胚胎移植志愿者剩余的胚胎分离 137个单细胞用荧光定量 PCR方法进行分析。 结果 用单个淋巴细胞诊断β-地中海贫血扩增效率达 96 % ,准确率达 99%～ 10 0 % ,等位基因丢失 (ADO)率仅 0～ 5 %。单个胚胎细胞扩增效率 86 %。 结论 荧光定量 PCR技术是一种敏感、快速、可靠和准确的技术 ,适合包括β-地中海贫血在内的单基因疾病的种植前诊断。

沙门氏致病菌标准阳性模板的构建及实时荧光定量聚合酶链式反应检测

目的:构建重组质粒作为标准阳性模板,建立食品中沙门氏致病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法。方法:以致病性沙门氏菌inv A基因上特异性片段为目标,设计并合成引物和Taq Man探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性。结果:构建出致病性沙门氏菌特异性基因片段的重组质粒,能够作为实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的标准阳性模板,标准曲线方程为Y=-3.151 lg X+42.86(R2=0.999),灵敏度80拷贝反应体系,能特异区分沙门氏菌与类型的细菌,同时,批内和批间的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。结论:本方法能够实现对食品中致病性沙门氏菌进行定性定量检测。

反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2 mRNA

目的:建立反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)mRNA的方法。方法:以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照,通过优化RT-PCR条件定量MIP-2 mRNA的表达。结果:获取了PCR线性扩增范围,确定了RT-PCR的最佳循环次数和模板量。结论:优化的RT-PCR方法可以用于MIP-2 mRNA的分析。

基于LNA-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术的药用黄精掺伪研究

目的:建立一种快速、灵敏、有效的实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,用于检测湖北黄精掺伪药用黄精。方法:基于锁核酸(LNA)-TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,利用不同基原药用黄精样品的叶绿体DNA中trnC-petN基因序列差异,根据常见混伪品湖北黄精特异性差异位点设计筛选探针引物,并对引物及LNA-TaqMan探针的特异性进行验证。根据扩增曲线临界循环数(Ct)值的差值计算湖北黄精掺伪比例。结果:基于LNA-TaqMan探针能够特异性地检测出湖北黄精并确定掺伪比例,在湖北黄精掺伪1%时,仍可稳定检出。结论:该方法简便准确、稳定可靠,可以用于药用黄精掺伪湖北黄精定量检测。

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

基于单核苷酸多态性位点的多重实时荧光定量聚合酶链式反应法鉴别当雄高山牦牛肉

通过比对5个不同地区牦牛线粒体基因的差异,筛选出用于鉴定当雄高山牦牛的11个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,将这些SNP位点作为引物3′端,同时引入引物碱基错配理念,设计出8对特异性引物,构建出2个三重和1个二重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)体系,建立一种基于SNP位点和多重RT-PCR技术鉴别当雄高山牦牛肉的方法。结果表明:该方法特异性较好、简便快捷、结果直观可靠,能够有效鉴别当雄高山牦牛肉;方法中3个RT-PCR反应体系扩增产物对应的熔解温度(melting temperature,Tm)范围分别为反应体系A:73.1~75.2、76.0~77.3、79.0~80.0℃,反应体系B:69.5~72.8、75.0~77.9、78.5~80.0℃,反应体系C:76.1~78.1、79.5~80.7℃;根据3个反应体系中熔解曲线峰的有无以及Tm是否符合取值范围来判定样品是否为当雄高山牦牛肉;市售样品测定结果表明,该方法可用于实际样品中当雄高山牦牛肉的快速鉴别。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

硅对聚合酶链式反应抑制作用的实时定量实验研究

采用实时定量PCR的方法研究了硅表面对乙肝病毒(HBV)DNA扩增过程的抑制作用。实验中采用HF处理的H终止硅和与自然氧化的硅片作为样品,按照1.0mm2/μL和5.2mm2/μL的面体比(硅片总表面积与PCR反应液的体积之比)与PCR反应液预混合(未加DNA样品,同时,TaqDNA聚合酶的浓度分别为0.2U/35μL和1.0U/35μL),充分混合预设的时间后,取出硅片,汲取上清液与DNA样品混合后采用实时定量PCR仪SlanTM进行扩增。扩增结果的荧光曲线表明:自然氧化的硅样品对PCR抑制作用更强,其对Taq聚合酶的抑制效果大于4.4mU/mm2;高面体比条件下,即使在初始扩增阶段,也达不到理想的指数形式;缩短芯片反应时间有利于降低材料对扩增的抑制效应。

酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR法对乙型肝炎的诊断价值比较

目的比较酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在乙型肝炎诊断中的应用价值。方法选取120例疑似乙型肝炎患者作为本次研究对象,分别进行酶联免疫吸附测定法以及实时荧光定量PCR法检验。以病理检查为金标准,分析酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR法的检查结果,对比两种检查方法的诊断效能,包括特异度、灵敏度以及准确度。结果120例疑似患者经病理检查确诊75例为乙型肝炎。酶联免疫吸附测定法检出阳性74例,阴性46例;实时荧光定量PCR法检出阳性75例,阴性45例。实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎的特异度、灵敏度以及准确度分别为93.33%、96.00%、95.00%,均明显高于酶联免疫吸附测定法的73.33%、82.67%、79.17%,差异有统计学意义(χ^(2)=6.4800、6.9963、13.3724,P<0.05)。结论采用实时荧光定量PCR法进行乙型肝炎的检测具有较高的准确率,可以为医生诊断和治疗方案的制定及调整提供良好的依据。

基于实时荧光聚合酶链式反应技术定量检测肉制品中动物源性成分研究进展

实时荧光聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)技术灵敏度高、特异性强,广泛用于肉制品中动物源性成分的定性、定量分析。已有多种基于RT-PCR技术的分析策略用于实现肉制品中动物源性成分的定量检测,已报道的定量分析策略各有优势及缺陷,目前尚无可推广的国家标准方法发布。本文针对采用RT-PCR技术对肉制品中动物源性成分定量检测的分析策略及其中的关键因素(结果表示形式、靶基因、DNA提取效率、DNA降解、扩增效率、标准物质、物种基因组大小)进行综述分析,为建立最优定量分析模型提供思路,期望找到操作简便、成本较低、可推广实施的定量分析策略,实现对肉制品中动物源性成分进行准确定量检测,促进国家标准检测方法的制定。