绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。

氟胁迫条件下茶树叶部实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

为了筛选氟胁迫条件下茶树(Camellia sinensis)叶部用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析的内参基因,以课题组前期筛选的低氟茶树品种福鼎大白茶和高氟茶树品种金观音为试验材料,利用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper软件,分析氟胁迫条件下(0.42 mmol·L^(-1)NaF)8个候选内参基因(CsACTIN、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsTBP、CsTIP41和CsUBC)在茶树不同叶位(新梢和老叶)、不同胁迫时间(0、1、3、7 d)的表达稳定性。结果显示,在氟胁迫条件下,茶树新梢中最优内参基因组合是CsEF-1α、CsTIP41、CsTBP和CsACTIN,老叶中最优内参基因组合是CsPP2A和CsUBC。利用筛选得到的最优内参基因组合分析氟输出蛋白基因(CsFEX)的表达情况,发现CsFEX在两个茶树品种的新梢和老叶中的表达趋势一致,说明筛选的内参组合可用于氟胁迫条件下茶树新梢和老叶中目的基因的检测。

猪萨佩罗病毒VP1基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

为建立用实时SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测PSVVP1基因表达量的标准曲线,试验根据目的基因在NCBI上CDS区的序列设计合成引物,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,采用real-time RT-PCR的检测方法,建立了检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线。试验结果显示,线性回归系数为0.9981,且熔解曲线只有一个峰值,表明由VP1目的基因所建立的标准曲线线性关系良好。试验成功建立了用SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线,为后续检测基因表达量的变化奠定了基础。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。

实时定量PCR应用于研讨式分组实验教学实践

实时定量PCR作为一项生命科学及其相关领域的重要技术,已成为高校生物实验教学中不可或缺的知识内容。以分子生物学实验基础教学内容为依托,围绕实时定量PCR技术面向本科生开设了综合性实验。在充分考虑学生的理论和操作水平以及本科实验教学特点的基础上,对实验设计和实验方法进行了优化,并采取研讨式分组教学模式,提高教学效率与教学质量的同时,更突出了学生在实验教学中的主体地位,有助于培养学生的科学思维、科学素养以及综合实践能力。

实时荧光定量PCR法与基因芯片法检测HPV的比较

目的比较基于PCR的基因芯片方法和实时荧光定量PCR方法检测女性子宫颈脱落细胞HPV DNA的相关性。方法收集2050份样本采用基因芯片法和实时荧光定量PCR方法进行比对试验,两者结果不符的进行测序验证,并对检测结果进行一致率及阳性率统计分析。结果两种方法总一致率、阳性一致率及阴性一致率都在95.0%以上;荧光定量PCR法检测HPV16阳性率50.0%,HPV18阳性率13.9%。结论两种方法检测的一致性良好,本实验中所使用的新型12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒适合应用于育龄期妇女的宫颈癌筛查及随访。

青海湖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因筛选与验证

为探明青海湖裸鲤候选内参基因在低温环境下的表达稳定性,根据RNA-seq定量结果筛选表达稳定的候选内参基因,利用实时荧光定量PCR检测候选基因在0℃和17℃下,脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量,并通过GeNorm、Norm Finder和Best Keeper3种分析程序分析其表达稳定性,筛选出理想的内参基因。结果显示:根据RNA-seq定量结果,共筛选获得脱水酶(Abhd18)基因、微球蛋白(B2m)基因、延伸蛋白A(Eloa)基因、DAZ相关蛋白2(Dazap2)基因、肌动蛋白(Actb)基因、磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)基因、BCL细胞死亡激动因子(Bad)基因和脂肪酸结合蛋白3(Fabp3)基因等8个候选基因;对上述基因的表达稳定性进行分析,发现表达最稳定的是B2m和Eloa基因,表达最不稳定的是Fabp3基因;利用B2m和Eloa基因作为双内参基因对4个脂肪酸代谢相关基因在0℃和17℃脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量进行校正,其相对表达比值与RNA-seq结果高度正相关。研究结果可为高原鱼类极端环境适应的研究提供候选内参基因。

实时荧光定量PCR检测鸭源鹅细小病毒方法的建立与应用

为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒(D-GPV)的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品的检测。结果显示,该方法标准曲线的的线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,检测底限为10拷贝;特异性与重复性好,与其他病毒无交叉反应,批间和批内变异系数均低于1%。该方法对人工感染D-GPV鸭泄殖腔拭子和咽拭子样品的检测结果显示,鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒,排毒量在第3 d达到高峰,排毒持续期可达到42 d。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于临床样品中的D-GPV检测。

枸杞实时荧光定量RT-qPCR内参基因筛选与验证

以9种不同基因型枸杞的不同组织(茎、叶、花、果)和不同发育期(FS_(1)~FS_(5))的果实为试材,选取Act-1/Act-3、Ef1a、Gapdh、H3b、Acx4、Pp2a、Rh37、Samc、Tub为候选内参基因,利用实时荧光定量技术(RT-qPCR)检测了9个候选基因在不同基因型枸杞的不同组织和不同发育阶段果实中的表达水平。并采用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct、RefFinder分析方法,评估候选内参基因的表达稳定性,并选择Beat基因验证内参基因。结果表明,Ef1a为不同基因型枸杞的不同组织和5个发育时期果实中表达较稳定的内参基因,Gapdh为表达最不稳定的内参基因;在宁夏枸杞中表达最稳定的内参基因为Rh37,其次为Ef1a。进一步采用Beat基因对不同基因型枸杞的不同组织(茎、叶、花、果)和5个发育时期果实中的表达模式进行验证,表明Ef1a、Act-1基因可作为枸杞稳定的内参基因。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。

猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。

牛呼吸道合胞体病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。

黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立

本研究成功建立了一种针对黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。该方法基于腐皮镰刀菌翻译延伸因子EF-1α基因序列,设计了特异性引物对FP.F/FP.R,并验证其特异性。建立腐皮镰刀菌的RT-qPCR检测方法;运用所建方法检测黄芪及土壤中腐皮镰刀菌的含量,验证其检测效果。结果表明:设计的引物FP.F/FP.R特异性强,RT-qPCR检测的灵敏度为0.0192 ng/μL,重复性评价显示方法稳定、可靠。应用该RT-qPCR方法,可从黄芪接种发病和疑似发病样本及土壤样本中检测出腐皮镰刀菌。结果表明,3组样本的总阳性检出率均为100%。同时,植株和土壤中腐皮镰刀菌的含量变化与根腐病的严重度基本一致。因此,本研究建立的RT-qPCR方法能够有效地用于黄芪植株及土壤中腐皮镰刀菌的定量检测,为根腐病的早期诊断、预警和病原菌的动态监测提供了重要的技术支持。

miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

西番莲中夜来香花叶病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物,建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物,退火温度54℃,引物浓度0.6μmol/L的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性扩增TeMV基因组6 483~6 675 nt区域,所得标准曲线扩增效率为10^(2).77%,决定系数为0.996 1,最低检测浓度为2.370×10^(2)拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的1 000倍。应用该方法对接种TeMV的西番莲进行检测,发现接种3 d后可在叶片中检测到TeMV,定量分析不同温度下TeMV在叶片中的积累,发现26~28℃下病毒积累速度最快,且植株症状表现与病毒积累量密切相关。对赣南地区采集的76份西番莲田间样品进行检测,共检出71份阳性样品,检出率为93.4%。综上,本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,适于TeMV的快速检测。

鸽圆环病毒Cap基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Cap保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1×10^(2)~1×10^(7) copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性,线性相关系数为0.9846;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到1×10^(2) copies/μL标准品,是常规PCR检测方法的100倍;特异性试验结果显示,该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于2%;所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床病死鸽肝脏样品检测结果显示,PiCV阳性率达75.7%,高于常规PCR方法的检测阳性率(54.1%),说明该方法具有良好的适用性。可应用于对PiCV的快速检测,为PiCV的及时防控提供有力技术支持。

实时定量PCR在皮肤癣菌病分子诊断中的研究进展

皮肤癣菌是皮肤癣菌病的致病真菌。传统直接镜检和培养,存在耗时费力、敏感性低、经验要求高等缺点。实时定量PCR(quantitative real time PCR,qPCR)技术具有快速、特异性高、敏感性高、无PCR后污染等优点,目前已应用于皮肤癣菌临床标本检测。该文通过回顾国、内外文献,介绍qPCR在皮肤癣菌病分子诊断研发、临床应用的研究进展。

实时荧光定量PCR检测猴痘病毒的方法研究

目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核酸进行检测,对RT-PCR方法检测临床样本能力进行评价。结果本研究建立的RT-PCR检测方法可实现猴痘病毒的特异性检测,与天花、痘苗、牛痘等其他正痘病毒无交叉反应,检测重复性好,最低检测限为103copies/μL。可以对人皮肤拭子样本中的猴痘病毒进行准确检测。结论本研究建立了猴痘病毒的RT-PCR检测方法,可在临床样本中快速、特异、灵敏的检测猴痘病毒。