实时定量PCR芯片——功能基因组研究的有用工具

结合实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和基因芯片技术,实时定量PCR芯片(qPCR array)为功能基因组研究提供了一种高度灵敏、可靠的方法。在基因功能分类基础上,结合qPCR准确定量的特性,qPCR array可同时定量分析上百个基因的mRNA表达水平,是研究一组特定功能基因表达的理想方法。

利用端粒和端粒酶PCR芯片筛选易发/抗肺纤维化小鼠肺组织差异基因研究

目的通过建立易发/抗放射性肺纤维化(RIPF)小鼠模型,利用端粒和端粒酶实时荧光定量PCR(RT-qPCR)芯片筛选易发/抗RIPF小鼠照射前后肺组织差异基因并初步验证。方法采用20 Gy^(60)Coγ射线照射C57BL/6J和C3H/HeN小鼠胸部;通过HE、天狼星红染色,羟脯氨酸、转化生长因子β(TGF-β)和结缔组织生长因子(CTGF)含量检测等,比较这两种小鼠RIPF进程的差异;采用端粒和端粒酶RT-qPCR芯片,分别比较照射前、照射后3个月两种小鼠肺组织端粒和端粒酶相关基因的表达差异,并采用RT-qPCR对差异基因进行初步验证。结果照射后3个月,C57BL/6J小鼠肺组织纤维化性病变较C3H/HeN小鼠更为明显;C57BL/6J小鼠肺组织中羟脯氨酸含量显著高于照射前和C3H/HeN小鼠(P<0.05),且其肺泡壁Ⅰ型胶原沉积显著多于C3H/HeN小鼠;C57BL/6J小鼠肺组织促纤维化细胞因子TGF-β和CTGF含量明显高于C3H/HeN小鼠(P<0.05)。端粒和端粒酶RT-qPCR芯片筛选发现,两种对照组小鼠肺组织差异基因48个;照射后3个月两种小鼠肺组织差异基因32个;照射后3个月,C57BL/6J小鼠肺组织与照射前相比有8个差异基因,C3H/HeN小鼠肺组织与照射前相比有4个差异基因。对差异基因端锚聚合酶2(Tnks2)基因进行验证,照射前及照射后3个月C3H/HeN小鼠肺组织中Tnks2的表达均高于C57BL/6J小鼠(P<0.05)。结论^(60)Coγ射线照射前后易发/抗肺纤维化小鼠肺组织存在多个端粒及端粒酶相关差异基因。

海水浸泡对血管内皮功能基因的影响

目的血管内皮细胞不仅是机体循环系统和组织间的重要屏障,而且具有重要的代谢和内分泌功能。本研究主要观察海水对血管内皮功能基因表达的影响。方法12只Wistar大鼠随机均分为腹部开放伤合并海水浸泡组(实验组)和单纯腹部开放伤组(对照组),分别于海水浸泡或术后2h采集腹部开放伤大鼠小肠系膜血管组织,以实时定量PCR芯片法检测两组血管内皮通透与张力、血管生成、内皮激活与损伤等相关的84个功能基因的表达差异。差异表达大于2倍视为表达上调或下调。结果与单纯腹部开放伤相比,腹部开放伤合并海水浸泡大鼠小肠系膜血管内皮77.38%(65/84)的功能基因表达水平发生了明显改变,分别有61.90%(52/84)和15.48%(13/84)的基因表达水平上调和下调。其中,趋化因子Cxcl2表达水平升高了29.82倍,L-选择素表达水平下降了46.59倍。全部血管通透性与张力相关基因(12/12)和凝血激活相关基因(6/6)表达改变大于2倍。结论海水浸泡广泛引起腹部开放伤大鼠血管内皮重要功能基因表达改变,内皮功能受损。

OSW-1与线粒体DNA缺失对肝癌细胞PI3K信号通路的影响

目的:探讨OSW-1与线粒体DNA缺失对肝癌细胞PI3K信号通路的影响。方法:以SK-Hep-1细胞为对照组,建立线粒体DNA缺失的ρ0-SK-Hep-1细胞模型(试验组2),使用荧光实时定量PCR芯片比较两组细胞PI3K信号通路的表达差异。OSW-1干预SK-Hep-1(试验组1)及ρ0-SK-Hep-1(试验组3)细胞24 h后,使用荧光实时定量PCR芯片比较两组细胞PI3K信号通路的表达差异。结果:SK-Hep-1细胞线粒体DNA缺失后细胞信号传导通路中基因:CASP9、CD14、FOXO1、GJA1、GRB2、HSPB1、IGF1、MAPK3、PDPK1、PRKCA、RPS6KA1、TLR4、TSC2表达上调;APC、CTNNB1表达下调。OSW-1作用于SK-Hep-1细胞后细胞信号传导通路中基因:FOS、GRB2、HSPB1、IRAK1、PDPK1、PRKCA、PRKCB、TLR4、TOLLIP、TSC2表达上调;APC、IGF1、IRS1、PDGFRA、PTPN11、SHC1表达下调。OSW-作用ρ0-SK-Hep-1细胞后细胞信号传导通路中基因:AKT1、CDC42、CDKN1B、FASLB、IRAK1、IRS1、PDGFRA、PDK2、PIK3R2、PRKCB、SHC1、TIRAP、TOLLIP等表达上调。BAD、EIF2AK2、FOXO1、IGF1、PABPC1、PAK1、PDK1、PDPK1、PIK3CG、RAC1、RASA1、RHOA、SOS1、TLR4、WASL等表达下调。结论:OSW-1和线粒体DNA缺失均能影响SK-Hep-1细胞PI3K信号传导通路基因的表达。OSW-1靶向作用于SK-Hep-1细胞的线粒体,抑制其功能。OSW-1靶向抑制肝癌细胞IGF-1-PI3K-AKT信号传导通路;Grb2-p85-AKT信号传导通路;IRS1-PI3K-AKT-GLUT-4信号传导通路;PI3K-AKT-TSC1/TSC2-m TOR信号传导通路;TLR4-PI3K-AKT细胞信号传导通路,从而抑制肝癌细胞生长、增殖、能量代谢。

qPCR array检测分析C57BL/6小鼠胚胎后肢发育基因表达谱

目的:胚胎生育过程中因肢体发育异常造成的出生缺陷比率不低,其相关基因表达模式尚不明确。本实验通过建立实时定量PCR芯片(Real-time quantitative polymerasechain reaction array,qPCR array)检测方案,研究C57BL/6品系小鼠后肢发育相关基因的表达谱。方法:以同源异形盒基因家族(Hox)、Wnt5a、配对同源结构域基因(Pitx1)、成纤维生长因子(Fgf8)、音猬因子(Shh)等小鼠肢体发育相关的重要基因制作基因检测表达谱,以C57BL/6品系怀孕雌鼠为材料,取胚胎肢芽发育的四个关键时期(E10.5,E11.5,E12.5,E13.5)的胎鼠后肢,利用qPCR array方案检测表达谱中基因的相对表达水平差异。结果:通过已建立的qPCR array检测了C57BL/6品系小鼠胚胎后肢发育时期Hox家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Shh等基因的表达差异。以E10.5为对照,检测出在后肢发育时期基因呈三种表达模式,即Hoxb6、Hoxb8、Hoxc8、Hoxc9、Hoxc10、Hoxd9和Shh基因的表达水平呈上调;Hoxa11、Hoxa13、Hoxc12、Hoxc13、Hoxd13等基因表达出现下调;Hoxc9、Hoxc10、Hoxc11、Hoxd9、Hoxd12、Fgf8和Pitx1等基因的相对表达量呈先上调后下调的曲线表达模式,且有少部分基因在小鼠后肢发育时期表达水平无明显变化。结论:Hox家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Shh等基因在小鼠后肢发育时期表达,并且表达模式存在明显差异。

qPCR array检测高糖对胆固醇合成基因表达的影响

目的:高血糖易引起胆固醇在体内积聚,增加糖尿病合并动脉粥样硬化性心血管疾病的患病风险。本文通过建立稳定的实时定量PCR芯片(Real-time quantitative polymerasechain reaction array,qPCR array)检测方案,研究高糖对小鼠肝癌细胞Hepa1-6胆固醇合成基因表达的影响,探讨胆固醇合成基因在糖尿病大血管并发症发展中的作用机制。方法:以不同浓度葡萄糖(5、15、30mmo/L)和不同时间(0、6、12、18、24 h),刺激肝癌细胞Hepa1-6,利用qPCR array检测其胆固醇合成基因的表达差异。结果:与5mmol/L相比,高糖组(15、30 mmo/L)处理细胞18 h后,胆固醇合成基因CYP51、EBP、NSDHL、SQLE、FDFT1和PMVK的表达上调(P<0.05),呈现剂量依赖性。与0 h相比,15 mmol/L高糖处理细胞12 h,CYP51、EBP和SQLE mRNA表达量上调(P<0.01)。至24 h,CYP51、EBP降至0 h水平,而SQLE的表达量继续增加;NSDHL在12 h表达无差异,至18 h表达量发生上调(P<0.05)。结论:该qPCR array检测方案能特异性检测胆固醇合成基因的表达量。高糖能够促进胆固醇合成基因的表达,使细胞内胆固醇积聚,这可能是糖尿病患者容易发生动脉粥样硬化的原因。这提示我们将胆固醇合成基因作为药物靶点可能延缓糖尿病动脉粥样硬化进展。

艾滋病免疫重建不全患者Toll样受体信号转导通路改变及免疫2号方干预的影响

目的:采用基因芯片技术,从Toll样受体信号转导通路的角度,探讨艾滋病免疫重建不全患者的免疫失调机制及中药免疫2号方的干预作用。方法:采集4例艾滋病免疫重建不全患者疗前以及联合中药免疫2号方干预6个月后的外周血单个核细胞(PBMC),另以4例HIV抗体阴性健康献血员做对照,抽提mRNA,通过逆转录后以TLRs信号通路实时定量PCR芯片进行杂交,采用ΔΔCt方法计算RNA表达量,寻找TLR通路上显著表达的差异基因。结果:筛选出与艾滋病免疫重建不全有关的基因显著上调≥2倍的有5个(干扰素-γ、IL-6、IL-8等),下调≥2倍的基因有4个(TLR9、NF-κB等),通路上游以基因下调改变为主(TLR9、TOLLIP、TRIF等),下游则多为上调改变(AP-1、IL-6、IL-8)。联合免疫2号方干预后,相关基因显著上调≥2倍的有7个(IL-2、IL-10、TLR1等),无显著下调基因,对通路上游基因的上调作用最为显著(如TLR1、CD14、TRAF6)。结论:HAART免疫重建不全的艾滋病患者细胞内TLR9较正常人表达低下,IRAK1、NF-κB表达下调,提示TLR9介导的信号转导系统异常是艾滋病患者免疫重建不全发生的可能机制之一;免疫2号方调节机体免疫功能的机制可能主要通过上调TLR1和CD14表达,进而引起下游一系列通路信号分子传递而实现。

Toll样受体信号通路相关基因在肾阳虚证中的表达差异性研究

目的探讨Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)信号通路相关基因在肾阳虚证中表达的差异性。方法采集15例肾阳虚证患者和10例健康人的外周血白细胞,应用TLRs信号通路实时定量PCR芯片技术,比较肾阳虚证组与健康对照组之间TLRs信号通路相关基因表达的差异。结果在84个TLRs信号通路相关基因中,肾阳虚证组与健康对照组比较,共检测到28个差异表达基因(P <0. 05),其中,有4个基因表达上调,24个基因表达下调,下调基因占总差异表达基因的85. 7%。在芯片中包含的10个TLRs基因(TLR1-TLR10)中,除了TLR3之外,其余均出现差异表达;在TLRs信号通路众多接头分子中,MyD88出现差异表达。结论肾阳虚证出现了大量TLRs信号通路相关基因的差异表达,其总体表达趋势以下调为主。接头分子MyD88的差异表达提示MyD88依赖信号转导途径异常可能是肾阳虚证发生的重要机制之一。