实时无标记肿瘤细胞凋亡筛选技术体系的建立

将xCELLigence-RTCA细胞分析系统的实时无标记技术和流式细胞术结合,建立实时无标记的肿瘤细胞凋亡筛选技术体系。利用顺铂诱导非小肺癌细胞A549凋亡,使用xCELLigence-RTCA系统连续监测96 h获取A549细胞动态生长曲线图谱,分析图谱确定细胞凋亡最佳检测时间点和半有效抑制浓度(IC50),联合流式细胞术的精准定量技术,分析顺铂作用后A549细胞的凋亡率。结果确定这种实时无标记细胞凋亡筛选技术体系用于肿瘤细胞凋亡筛选的可行性和可靠性。

实时无标记细胞分析系统与传统MTT法在测定乳腺癌细胞增殖中的比较

目的:通过实时无标记细胞分析法与传统MTT法对乳腺癌细胞增殖进行监测以对比确定研究细胞增殖的最佳实验方法手段。方法:采用MTT法、实时无标记细胞分析法测定瘦素刺激乳腺癌MCF-7细胞增殖的效果。结果:MTT法和实时无标记细胞分析法结果均表明瘦素作用浓度为0.625 nmol/L、作用时间为24 h的条件下对乳腺癌MCF-7细胞有诱导生长的效果。但实时无标记细胞分析法能够实时监测细胞生长和增殖的动态生物学反应过程,观察效果更加直观、准确。结论:实时无标记细胞分析法可较好地弥补MTT法的缺点,成为一种新的研究细胞增殖的实验方法。

流式细胞术对恶性淋巴瘤细胞膜表面标记及倍体分析

恶性淋巴瘤中的肿瘤细胞膜表面标记常异常表达,核型以异倍体为多。采用流式细胞术检测不仅可以分析细胞的膜表面标记,还可进行DNA含量测定,并进行参数分析。因而对疾病分型诊断和治疗评价发挥重要作用。本文就恶性淋巴瘤患者流式细胞分析与恶性淋巴瘤的诊断、临床特点之间的关系进行讨论,并说明该项技术与病理诊断的关系。

基于RTCA技术研究抗体偶联药物的旁观者效应的检测方法

目的 利用实时无标记细胞分析(RTCA)系统评估抗体偶联药物(ADC)的旁观者效应。方法 采用RTCA系统监测抗原阳性细胞(Ag^(+))和抗原阴性细胞(Ag^(-))的共培养状态,观察Ag^(-)的细胞存活情况;采用重复实验验证结果的可靠性和一致性,并采用单因素方差分析比较不同细胞比例培养组在单个时间点的Ag^(-)存活率。结果 加入抗体偶联药物后,随着共培养时间的延长,Ag^(-)存活率下降;此外,在单个时间点(96 h)上,与0%Ag^(+)细胞的Ag^(-)细胞存活率相比,10%Ag^(+)细胞的Ag^(-)细胞存活率为89.07%(P=0.156),25%Ag^(+)细胞的Ag^(-)存活率为68.93%(P=0.0026),50%Ag^(+)、75%Ag^(+)和90%Ag^(+)细胞的Ag^(-)存活率分别为35.28%、13.99%和12.02%(P<0.0001)。在 Ag^(+)细胞比例为25%~90%时,旁杀伤效果显著;重复性结果显示不同Ag^(+)细胞的旁杀伤率的相对标准偏差(RSD)均小于30%。结论 结合RTCA技术和共培养方式的方法,可以更准确地模拟旁观者效应的生物学过程,为后续的抗体偶联药物开发提供有价值的参考。

RTCA技术检测NK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞的杀伤效应

目的:利用实时无标记细胞分析技术(RTCA)检测NK细胞介导的抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)作用。方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离正常外周血的单个核细胞(PBMC),PBMC在体外经K562工程细胞及细胞因子诱导活化扩增为NK细胞(14 d),采用流式细胞仪检测NK细胞表面分子及分析其纯度,采用RTCA技术及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测NK细胞毒作用,RTCA检测NK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞株杀伤作用。结果:流式细胞结果显示,经过14 d体外扩增培养后NK细胞的纯度可达86.2%;NK细胞毒作用结果显示,随着效靶比的增加(1∶1、5∶1、10∶1),LDH和RTCA检测NK细胞的杀伤作用趋势基本一致;RTCA结果显示NK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞株杀伤作用明显高于单一的NK细胞组。结论:RTCA技术为检测NK细胞介导的ADCC作用提供了一种简便、动态及灵敏的新方法。

采用超高效液相色谱质谱联用技术区分肝细胞癌和肝硬化患者的代谢组学概况

背景：肝细胞癌在世界范围内居恶性肿瘤的第五位,通常是由肝硬化发展而来。区分两者的生物标记物是至关重要而又有限的。方法：在本研究中,采用超高效液相色谱质谱（UPLC-MS）-基于代谢组学的方法来描述82例肝癌患者,48例肝硬化患者和90例健康对照者之间血清代谢产物的特征,并比较了UPLC-MS轮廓和甲胎蛋白水平在肝癌诊断中的准确性。结果：通过多元数据和受试者工作特征（ROC）曲线分析,代谢轮廓分析不仅可以区分患者与健康对照组,并且对于肝硬化和肝癌患者之间的区别有100%的敏感性和特异性。在肝癌患者中有13种潜在生物标记物被鉴定并被认为对关键代谢途径有显著干扰,比如有机酸、磷脂类、脂肪酸、

慢病毒转导敲低Smad7表达对大鼠原代心肌成纤维细胞增殖、迁移、细胞表型分化和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的探讨Smad7敲低后对原代心肌成纤维细胞增殖、迁移、胶原分泌和细胞表型转化的影响。方法原代培养10只SD大鼠乳鼠的心肌成纤维细胞,免疫组织化学染色鉴定细胞。采用慢病毒转染方法敲低心肌成纤维细胞Smad7的表达,Western blotting验证Smad7蛋白敲低效率,实时无标记细胞仪检测心肌成纤维细胞的增殖情况,细胞划痕实验检测细胞的迁移情况,Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和细胞表型转化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。结果成功培养心肌成纤维细胞,并进行细胞鉴定。慢病毒转染的心肌成纤维细胞感染复数(MOI)值为100,转染后88.33%的细胞表达绿色荧光蛋白,慢病毒敲低组Smad7的蛋白表达明显下调(P<0.05)。慢病毒敲低Smad7后细胞增殖明显下降(P<0.01),细胞迁移率明显减少(P<0.01)。与对照组相比,慢病毒敲低组细胞ColⅠ表达明显下降(P<0.01),α-SMA表达明显升高(P<0.01)。结论Smad7表达敲低后,心肌成纤维细胞的细胞功能发生明显改变,这些改变可能与Smad7下调导致心肌纤维化程度加重有关。

罗氏-ACEA非标记实时细胞分析技术专题讨论会在京举行

5月9日北京翠宫饭店，罗氏应用科学公司和ACEA Biosciences公司联袂举行了“非标记、实时细胞分析技术专题讨论会”。会议旨在通过对创实时细胞检测技术的介绍，及其在先进的基因分析平台上的应用讨论，提升整个生命科学研究及药物研发产量和质量。尽管基于细胞的检测技术目前已经被广泛应用；但由于实验过程中使用的标记和报告基因有可能会干扰研究状态下的多个生物学过程，

四色荧光标记抗体在白血病免疫分型中的应用及意义

为探讨多参数流式细胞术对白血病免疫分型的方法及意义 ,本研究自行设计了一系列 4种荧光标记的单克隆抗体组合 ,对 88例急性白血病患者骨髓或外周血进行流式细胞仪免疫表型分析。应用本组抗体组合可对T ALL和B ALL及AML M1 -M7患者做出诊断 ,并可诊断形态学难以辨认的AML M0 ,及一般免疫分型法较难辨认的单核细胞白血病。应用 4组四色荧光标记的抗体组合 ,共含 1 3种抗体 ,既可将 90 %以上的白血病患者分为ALL或AML ,并可鉴别急性白血病的主要亚型 ,及反映血细胞的分化成熟度。结论 :四色荧光抗体组合可用较少的抗体 ,特异地对白血病细胞进行多参数免疫分型分析 。

三色荧光标记抗体在急性白血病免疫分型中的应用

目的 :探讨多参数分析流式细胞术白血病免疫分型的方法。方法 :用自行设计的七组三色荧光标记抗体组合 ,共含 15种抗体 ,对 2 0 0例急性白血病患者骨髓或外周血进行流式细胞术免疫分型。结果 :应用本组抗体组合可对T 急性淋巴细胞白血病、B 急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病 M1 M7患者作出免疫学诊断 ,并可诊断形态学难以辨认的及一般免疫分型法较难诊断的单核细胞白血病。结论 :三色荧光标记抗体组合可用较少的抗体 ,特异地对急性白血病各亚型进行多参数免疫表型分析 。

罗氏xCELLigence系统：实时、无标记细胞分析检测技术

目前，大部分细胞检测方法采用的仍是传统的终点法——仅仅给实验定格了一个最终结果，而且经常需要标记和破坏细胞。这就是当前细胞分析方法的最大局限性，因为细胞是活体，其生物学和细胞效应过程应该是动态而非静态的。因此，为了更充分的了解和测量生物学和细胞效应，最理想的选择应当是使用一种对细胞无侵入性的系统，并能检测到细胞对某些刺激（如药物处理或某种生长因子刺激）应答产生的全过程动态反应信息。

罗氏xCELLigence：非标记的、动态实时细胞分析检测技术

目前，大部分细胞检测方法采用的仍是传统的终点法——仅仅给实验定格了一个最终结果，而且经常需要标记和破坏细胞。这就是当前细胞分析方法的最大限制，因为细胞是活体，其生物学和细胞进程是动态而非静态的。因此，为了更充分的了解和测量生物学和细胞进程，应当使用一种非侵入性的系统，来记录细胞应答某些刺激（如药物处理或某种生长因子刺激）时所产生的动态变化。

过继转输的父系抗原耐受T细胞诱导受体母-胎免疫耐受的机制研究

本文目的是为了探讨过继转输的父系抗原耐受T细胞对受体孕鼠反应性T细胞的影响。以(?)CBA/J×(?)BALB/c为正常妊娠模型,(?)CBA/J×(?)DBA/2为自然流产模型,将自然流产模型CBA/ J孕鼠于孕第4天(着床期)分别腹腔注射大鼠抗小鼠CD80和CD86 mAb或大鼠同型IgG。于孕第9天,应用免疫磁珠阴性分选孕鼠的脾脏T细胞,将纯化的T细胞先进行CFSE体外荧光标记,再分别过继转输至孕第4天的CBA/J×DBA/2孕鼠。于受体孕鼠孕第9天,在父系抗原刺激下,采用单向混合淋巴细胞反应分析受体孕鼠脾脏免疫细胞对父系抗原的增殖能力,并用流式细胞术分析过继转输的T细胞及受体T细胞内细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ及细胞表面协同刺激分子CTLA-4的表达。本文结果显示,与过继转输父系抗原非耐受性T细胞相比,转输父系抗原耐受性T细胞和转输正常妊娠模型孕鼠T细胞均使受体孕鼠脾脏免疫细胞对父系抗原的增殖能力显著下降(P<0.05);同时使受体孕鼠T细胞内细胞因子IL-10及细胞表面CTLA-4的表达显著增加,而细胞因子IL-2和IFN-γ的表达则明显下降(P<0.05),细胞因子IL-4的表达不变(P>0.05)。总之,过继转输的父系抗原耐受T细胞具有抑制性免疫调节功能,诱导受体孕鼠反应性T细胞对父系抗原亦产生免疫耐受,两者协同作用则抑制母体对胚胎的免疫排斥,明显改善了自然流产模型孕鼠的妊娠预后。

236例SARS患者外周血中幼稚和记忆CD_4T细胞亚群变化

目的 :研究严重急性呼吸综合征 (SARS)患者外周血T淋巴细胞及CD4细胞中幼稚亚群 (Tn)和记忆亚群 (Tm)的异常变化 ,以期更好地了解SARS患者细胞免疫功能 ,从而建立新的实验室指标。方法 :采用多色荧光标记流式细胞术结合血液分析仪检测 2 3 6例不同病程的SARS患者 (包括 5 0例重型患者和 1 86例普通型患者)的外周血T淋巴细胞及CD45RA和CD45RO分子在CD4细胞中的表达情况。结果 :与正常对照组比较 ,SARS患者的外周血T淋巴细胞及CD4细胞中Tn和Tm绝对值明显减低 ,其百分比无明显改变 ,重型尤其明显。其中 ,重型组CD4细胞中的Tm百分比高于普通型 ;各病程SARS患者比较 ,三个病程组的T淋巴细胞计数均明显低于正常对照组 ,以Ⅰ组为最低 ,CD4、CD8亚群的绝对值均低于正常对照组 ;在CD4细胞中 ,各病程Tn和Tm的百分比无明显差异 ,绝对值以Ⅱ组最高 ,但均低于正常对照组。结论 :伴随着全面低下的细胞免疫功能 ,SARS患者的CD4+ T细胞的Tn和Tm均明显减少 ,重型尤其明显 ,但是在病程中可有轻度回升。相对于百分比而言 ,CD4细胞中Tn和Tm表面标志分子 (分别为CD45RA和CD45RO分子 )表达绝对值对于明确机体细胞免疫功能的意义更为重要。

实时无标记细胞分析系统(RTCA)在药物心肌毒性检测和生物活性研究中的应用

实时无标记细胞分析系统(Real timexCELLigence analysissystem,RTCA)是一种新型细胞检测技术,能够连续监测、记录及分析细胞活动产生的各种信息,在药物研究中的心肌毒性评估和细胞生物活性考察方面都可以发挥重要作用。文中首先对RTCA的原理与特点进行了介绍,然后分别对RTCA在心肌毒性和细胞生物活性研究中的应用现状进行了综述,为了解和使用RTCA提供了参考。RTCA技术具有实时无标记、非侵入性、高通量、准确性高等特点,不仅有助于药物研究和新药开发,在其他一些领域也有着广阔良好的应用前景。

蜕膜巨噬细胞调控滋养细胞侵袭力的研究

目的探讨蜕膜巨噬细胞对滋养细胞侵袭力的调控。方法取20~35岁女性正常早孕(6~7+6周)行人工流产的蜕膜组织15~20 g。将蜕膜组织充分清洗后使用Collagenase和Dnase消化2次,每次30 min,细胞悬液过滤后通过CD14+免疫磁珠分选,并行免疫荧光鉴定。流式细胞仪分析巨噬细胞M1型(CD80+和CD86+)和M2型(CD163+和CD206+)。获得的巨噬细胞置于6孔板培养,24 h后收集细胞上清。巨噬细胞上清与滋养细胞系HTR-8/SVneo共培养24 h,实时定量PCR检测HTR-8/SVneo的水通道蛋白1(AQP 1)mRNA相对表达量变化,以及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9 mRNA相对表达量的变化。应用实时无标记细胞分析技术(RTCA)检测人早孕蜕膜巨噬细胞上清对人滋养层细胞系HTR-8/SVneo侵袭力的影响。结果成功建立人类早孕蜕膜巨噬细胞体外培养体系。流式细胞检测显示,人类正常早孕蜕膜组织中巨噬细胞以M2型为主,约占全部巨噬细胞的87%。巨噬细胞上清使HTR-8/SVneo的AQP 1和MMP-9 mRNA相对表达量升高(P均<0.001)。RTCA结果显示巨噬细胞上清明显增强HTR-8/SVneo的侵袭力(P <0.001)。结论体外培养条件下,蜕膜巨噬细胞可能通过介导AQP1表达升高而增强滋养细胞的侵袭力。

检验医学新技术发展的现状

当今由于分子生物学新技术、标记免疫分析技术、生物传感器技术、流式细胞技术、自动化与信息技术的发展及其在人类战胜各种疾病,如：传染性疾病、肿瘤、心脑血管疾病、遗传性疾病等方面的早期诊断中的应用,使得检验医学诊断技术的发展成为临床疾病诊断的先驱.

临床常用中药制剂对OVCAR3细胞的药效学比较

目的比较临床常用中药制剂对OVCAR3细胞OVCAR3的药效学。方法以采用实时无标记细胞分析(RTCA)检测榄香烯注射液、参芪扶正注射液、艾迪注射液、复方苦参注射液、消癌平注射液、康艾注射液、康莱特注射液对OVCAR3细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用,JC-1检测上述药物对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响,CCK8法检测它们对正常细胞系MRC-5的毒性作用。结果榄香烯注射液、消癌平注射液、复方苦参注射液、艾迪注射液抑制OVCAR3细胞增殖的IC_(50)值分别为(44.98±0.13)μg/mL、(258.78±6.53)mg/mL、(121.73±1.23)mg/mL、(51.73±0.51)mg/mL,中、高剂量榄香烯注射液有明显抑制OVCAR3细胞迁移的作用;除康莱特注射液外,其他药物都有一定程度抑制OVCAR3细胞侵袭的作用。榄香烯注射液、消癌平注射液在IC_(50)剂量下作用24 h后,可检测到线粒体膜电位的改变。榄香烯注射液、艾迪注射液IC_(50(MRC⁃5))/IC_(50(OVCAR3))均大于1。结论以OVCAR3细胞为对象时,榄香烯注射液抗肿瘤作用最好,其次是艾迪注射液。

多壁碳纳米管致人肝癌细胞HepG2毒性及代谢酶表达变化

采用实时无标记细胞分析系统研究多壁碳纳米管(MWCNTs)对人肝癌细胞HepG2毒性作用,确定MWCNTs是否会影响肝脏代谢酶谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)和细胞色素P450亚酶CYP1A1的表达。利用0.12、0.25、0.5、1和2 mg/mL的MWCNTs处理HepG2细胞24、48和72h后,采用噻唑蓝比色法(MTT)测定MWCNTs对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用。利用实时无标记动态细胞分析(RTCA)系统动态监测不同剂量(0.25、0.5、1 mg/mL)MWCNTs对HepG2细胞生长的影响。细胞经MWCNTs处理48 h后,实时定量荧光PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测肝脏代谢酶GSTP1和CYP1A1的mRNA水平和蛋白水平的变化情况。结果显示MWCNTs可以抑制HepG2细胞的增殖,且呈一定的剂量和时间依赖性。实时无标记细胞分析法能够准确监测MWCNTs对细胞增殖的过程,并且能避免多壁碳纳米管材料对数据的干扰。经MWCNTs处理后的细胞中肝脏代谢酶GSTP1mRNA水平和蛋白水平上调,而CYP1A1的mRNA水平和蛋白水平显著下降。

脐血来源NK细胞的体外扩增及其抗肿瘤细胞活性的研究

目的研究脐血单个核细胞来源NK细胞的培养方法及其对不同类型肿瘤细胞的杀伤活性。方法自脐静脉消毒后全封闭采集脐血,肝素抗凝,分离单个核细胞,用NK细胞培养基培养14 d,流式细胞仪检测其表面标志,并使用RTCA实时无标记细胞分析技术检测细胞增殖曲线,观察NK效应细胞按效靶比1:1、5:1与10:1对肿瘤细胞的杀伤作用。结果培养14 d的脐血单个核细胞,细胞总数扩增294倍,其中NK细胞扩增5580倍。NK细胞CD3^(-)CD56^(+)阳性率为97.93%,与杀伤功能相关的重要分子CD16、NKG2D、NKp30、NKp44的表达阳性率均在95%以上。对A549肺癌细胞株作用6 h的杀伤活性,在1:1~10:1效靶比范围内,随着效靶比增加,杀伤活性从(78.16±2.41)%逐渐增强到(95.71±3.21)%;并且在效靶比1:1的情况下,随着作用时间从6 h延长到24 h,杀伤活性也从(78.16±2.41)%逐渐增强到(96.33±2.15)%。结论建立了无需分选细胞、无需滋养层细胞、操作简单、通用性强的脐血NK细胞培养方法,获得的NK细胞纯度高,对肿瘤细胞的杀伤作用强。