目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA...目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。展开更多
目的:探讨同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)激活情况及激活相关因素。方法:52例接受allo-HSCT的患者为研究对象,所有患者及其供者移植前均为CMV携带者,即为CMV血清型阳性。所有移植术后患者应用...目的:探讨同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)激活情况及激活相关因素。方法:52例接受allo-HSCT的患者为研究对象,所有患者及其供者移植前均为CMV携带者,即为CMV血清型阳性。所有移植术后患者应用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法对CMVDNA进行定量检测。结果:移植后100d内,52例患者中28例检测到CMVDNA复制。造血干细胞移植(HSCT)供者类型和移植物抗宿主反应(graft versus host disease,GVHD)的发生与CMV激活明显相关(P值分别为0.018和0.039)。在44例可评估患者中,allo-HSCT100d后仅7例检测到CMVDNA复制,其发生率与移植后发生GVHD且接受激素治疗(P=0.0009)、人类白细胞抗原(HLA)全相合无关供者移植或者HLA部分相合同胞供者移植有关(P=0.037)。应用实时定量PCR检测发现,CMV对更昔洛韦抢先治疗的应答存在2种动力学模式(快速型和缓慢型),其中表现为缓慢型的患者CMV最高负载量较快速型高10倍以上,其病毒衰减时间也要延长3~4周,多数发生在因出现GVHD而接受激素治疗以及接受HLA全相合无关供者和HLA部分相合同胞供者干细胞移植的患者。结论:移植前CMV血清型阳性患者接受allo-HSCT后100d内出现CMV激活是常见并发症。移植100d之后,对于未发生GVHD而未使用激素治疗者或以HLA全相合同胞为供体的患者,CMV激活概率低,无需进行常规频繁监测。展开更多
文摘目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。
文摘目的:探讨同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)激活情况及激活相关因素。方法:52例接受allo-HSCT的患者为研究对象,所有患者及其供者移植前均为CMV携带者,即为CMV血清型阳性。所有移植术后患者应用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法对CMVDNA进行定量检测。结果:移植后100d内,52例患者中28例检测到CMVDNA复制。造血干细胞移植(HSCT)供者类型和移植物抗宿主反应(graft versus host disease,GVHD)的发生与CMV激活明显相关(P值分别为0.018和0.039)。在44例可评估患者中,allo-HSCT100d后仅7例检测到CMVDNA复制,其发生率与移植后发生GVHD且接受激素治疗(P=0.0009)、人类白细胞抗原(HLA)全相合无关供者移植或者HLA部分相合同胞供者移植有关(P=0.037)。应用实时定量PCR检测发现,CMV对更昔洛韦抢先治疗的应答存在2种动力学模式(快速型和缓慢型),其中表现为缓慢型的患者CMV最高负载量较快速型高10倍以上,其病毒衰减时间也要延长3~4周,多数发生在因出现GVHD而接受激素治疗以及接受HLA全相合无关供者和HLA部分相合同胞供者干细胞移植的患者。结论:移植前CMV血清型阳性患者接受allo-HSCT后100d内出现CMV激活是常见并发症。移植100d之后,对于未发生GVHD而未使用激素治疗者或以HLA全相合同胞为供体的患者,CMV激活概率低,无需进行常规频繁监测。