基于实时细胞电子分析技术的三七质量生物评价研究

目的:建立三七的生物质量控制与评价方法,通过测定其细胞指数值来评价不同产地三七的品质。方法:采用实时细胞电子分析技术(Real-Time Cell-based Assay,RTCA)考察三七提取物针对特定依赖性细胞株的生物细胞活性,分析样品在一定时间内的变化趋势和作用规律,并在最佳时间点测定其细胞指数值。结果:4批不同产地三七样品中,云南楚雄三七在最佳时间点38 h的细胞指数值最高,其生物活性最强。云南文山三七在最佳时间点38 h的细胞指数值最低,其生物活性最弱。结论:建立的基于RTCA的三七生物效价检测方法可初步用于三七质量的评价。

实时细胞电子分析应用于复方丹参滴丸质量评价的初步研究

目的建立复方药物复方丹参滴丸(CDDP)的生物活性检测方法;将细胞指数值(CI)与主要活性成分含有量进行相关性分析,为其质量控制提供研究基础。方法采用实时细胞电子分析技术(RTCA),测定样本对不同细胞株的IC50值,筛选出对复方丹参滴丸有特定依赖性的细胞株,对不同批次复方丹参滴丸建立时间剂量依赖性细胞反应曲线(TCRPs),以细胞指数值(CI)为考察指标,比较各批次药物的生物活性;测定复方丹参滴丸主要活性成分含有量,并与生物活性进行相关性分析。结果复方丹参滴丸在一定浓度范围内与空白相比对A549细胞株的增殖有明显的抑制作用(P<0.05),并有明显的量效关系(r>0.9);由TCRPs反映各批次滴丸质量稳定,但在特定时间点特定的浓度仍有一定差异,今后可用于同种药物不同批次间的稳定性研究;相关性结果表明复方丹参滴丸生物活性与丹参素含有量有显著性相关(P<0.05)。结论说明本技术能反映复方丹参滴丸生物活性,可与化学成分分析方法结合共同把关中药质量。

实时荧光定量PCR技术在肾移植术后巨细胞病毒性肺炎诊断中的应用

目的 探讨实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒在肾移植术后肺部感染诊断中的应用价值.方法 应用实时荧光定量PCR检测2002年1月至2006年1月在本院行肾移植术后肺部感染患者39例,健康自愿者50人的血清CMV DNA载量,应用SPSS10 0软件对检测结果进行统计学分析.结果 肺部感染患者组39份样本中,19份可以检测到数值(阳性率为49%),其病毒拷贝数值介于1.05×103～4.26×105之间,平均为2.23×104;对照组中仅一份检测到数值(阳性率为2%),且CMV DNA小于104,其余49份均低于检测下限,实时荧光定量PCR检测CMV结果对病情发展有预测价值.结论 实时荧光定量PCR技术为肾移植术后巨细胞病毒性肺炎的早期诊断提供了有效的试验手段,从而大大提高了肾移植术后巨细胞病毒性肺炎的治愈率.

基于RTCA技术的复方丹参片体外溶出与一致性评价研究

目的基于实时电子分析技术(Real-time cell-based assay,RTCA),探讨以细胞生物效应评价复方丹参片体外溶出度的可行性。方法依据大鼠心肌细胞(H9C2)对复方丹参片不同时间的溶出液呈现浓度梯度依赖,利用RTCA技术监测不同时间溶出药液的细胞动态变化,建立一种以细胞指数(Cell index,CI)为指标的溶出动力学模型。同时计算溶出度,与传统紫外分光光度法测定的溶出曲线进行相关性与一致性评价,利用DDSolver软件进行相关性分析。结果以紫外分光光度法所得到的溶出曲线作为参比,3个不同厂家的复方丹参片溶出曲线差异因子f1均小于15,相似因子f2均大于50。并且2种评价方法下,同一厂家复方丹参片的溶出曲线最佳拟合模型均一致。结论基于RTCA细胞生物效应评价方法可以基本反映复方丹参片体外溶出度的特征。以细胞指数为指标的溶出度评价方法有望成为中药固体制剂体外溶出度新的检测手段。

《单细胞分析》

单细胞分析是分析化学、生物学和医学多学科相互渗透发展形成的跨学科前沿领域。 分析化学新方法新技术丛书——《单细胞分析》，由武汉大学程介克教授等著。全书共分15章，全面系统地介绍了单细胞分析的各种方法，包括毛细管电泳、微流控芯片、多种光学显微镜（荧光显微镜、聚焦荧光显微镜、全内反射荧光显微镜、多光子荧光显微镜、荧光相关显微镜、近场扫描光学显微镜等）、扫描电化学显微镜、质谱成像、原子力显微镜、扫描隧道显微镜图像分析、阿达玛变换显微光谱及成像、肿瘤电化学及免疫分析、动力学分析、荧光及发光探针、纳米技术以及实时动态检测等新技术和新方法。

实时细胞分析技术与Alamar Blue法用于测定纳米氧化铜细胞毒性的比较研究

目的通过比较研究实时细胞分析技术(real time cell analyze,RTCA)及Alamar Blue法测定纳米氧化铜体外作用于人胚肺成纤维细胞MRC-5及人正常肺上皮细胞BEAS-2B的毒性作用,探讨RTCA实时细胞分析技术用于测定纳米材料体外细胞毒性的可行性。方法分别将MRC-5及BEAS-2B细胞接种于RTCA配套16孔板中及普通96孔板中,96孔板中细胞用于Alamar Blue法测定细胞毒性。分别用剂量为0.75g/L、0.38g/L、0.19g/L、0.094g/L、0.047g/L的纳米氧化铜混悬液进行染毒。选择12h、24h、36h、48h、60h时间点计算两种方法测得的IC50值。采用SPSS 16.0分析软件,利用配对t检验,对两种方法所得相同时间点的IC50值进行统计分析,判断其相关性及是否存在差异。结果 MRC-5细胞用RTCA法测定染毒后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h的IC50值分别为391 mg/L、249 mg/L、185 mg/L、165mg/L、147mg/L;Alamar Blue法所得相同时间点的IC50值分别为507 mg/L、206 mg/L、172 mg/L、154mg/L、95.2mg/L。两种方法所测得IC50值进行统计分析,差异无统计学意义。BEAS-2B细胞用RTCA法测定染毒后12h、24h、36h、48h、60h的IC50值分别为131 mg/L、83.78 mg/L、65.37 mg/L、53.98mg/L、51.23 mg/L;Alamar Blue法所得相同时间点的IC50值分别为148 mg/L、104 mg/L、77.3mg/L、42.5mg/L、39.2mg/L。两种方法所测得IC50值进行统计分析,差异无统计学意义。结论RTCA实时监测法与Alamar Blue法在相同时间点测定纳米氧化铜体外细胞毒性得IC50值差异无统计学意义,说明RTCA实时监测法测定体外细胞毒性结果可靠,适用于纳米材料的体外毒性研究。

实时细胞电子分析技术的应用研究进展

目的综述实时细胞电子分析技术的研究进展,为中药研究提供参考。方法根据近年来国内外相关文献,对实时细胞电子分析技术的原理、特点及其应用进行归纳总结。结果与结论实时细胞电子分析技术是一种无标记、无侵害的实时细胞电子分析方法。综述了实时细胞电子分析技术的应用研究进展,为其在药学领域进一步应用发展提供参考,并对其在中药及复方领域的应用前景进行了展望。

实时细胞电子分析技术用于水蛭、三七质量评价的初步研究

采用实时细胞电子分析技术测定水蛭、三七不同样本的时间剂量依赖性细胞反应曲线(TCRPs),对不同产地样本的TCRPs进行分析,并对生物活性强弱进行排序。同时,采用中国药典2010年版中的化学检测法和凝血酶滴定法分别对水蛭、三七各样本进行同步分析,比较不同检测方法得出结果的相关性。可见以实时细胞电子分析技术为基础的细胞生物活性测定结果与另两法所得结果基本一致。说明本技术能反映中药生物活性,有望为中药质量标准研究提供一种新方法。

生理状态下外周血白细胞IL-2基因表达的荧光定量PCR检测

目的:建立白细胞介素2(IL-2)基因表达的绝对定量实时PCR检测技术。方法:应用实时定量PCR方法检测25名健康运动员中IL-2mRNA的表达。主要结果和结论:应用实时定量PCR方法能够对健康受试者外周血白细胞自发性IL-2mRNA表达进行定量分析,相关系数r>0.99。

基于实时细胞分析技术评价注射用益气复脉(冻干)类过敏反应

目的建立中药注射剂体外类过敏反应评价方法,快速评价不同批次注射用益气复脉(冻干)类过敏反应表现。方法体外培养嗜碱性白血病细胞株RBL-2H3细胞,选择Compound 48/80为阳性药,采用实时细胞分析(real-time cell analysis,RTCA)系统检测药物干预后引起的细胞指数(CI)值变化,并利用甲苯胺蓝、鬼笔环肽染色观察细胞形态、骨架变化,以及检测组胺和β-已糖苷酶释放量验证RBL-2H3细胞的脱颗粒情况。选择20个批次的注射用益气复脉(冻干,100μg/m L)作用于RBL-2H3细胞,进行基于RTCA技术的类过敏反应评价。结果阳性药Compound 48/80(20μg/m L)能够使RBL-2H3细胞的CI值在加药后30 min内呈先快速上升后下降趋势;形态学研究发现,Compound 48/80使细胞形态和细胞骨架均发生明显改变,发生明显的脱颗粒现象;组胺和β-己糖苷酶释放实验进一步证实Compound 48/80导致炎症介质的释放,引起了明显的脱颗粒现象;提示RTCA系统可以用于快速敏感的评价RBL-2H3细胞脱颗粒。不同批次的注射用益气复脉(冻干)对RBL-2H3细胞CI值无明显影响,提示所选批次为合格批次,无类过敏反应现象的发生。结论建立了一套基于RTCA系统的类过敏反应体外快速评价技术,可用于注射用益气复脉(冻干)等中药注射剂类过敏反应的体外快速评价。

牛分枝杆菌重组蛋白TB10.4对RAW264.7细胞TLR2表达和分布的影响

为探讨牛分枝杆菌TB10.4蛋白与RAW264.7细胞的相互作用关系,表达纯化了rTB10.4,并采用IFN-γ释放试验和Western blot检测其细胞活性。使用不同剂量rTB10.4与RAW264.7细胞共孵育后,采用实时无标记动态细胞分析技术检测rTB10.4对RAW264.7细胞生长影响的最佳时间点和最佳剂量。在此基础上,采用量化流式细胞仪分析重组蛋白rTB10.4对RAW264.7细胞TLR2表达的影响。结果表明,获得的rTB10.4具有较强的T细胞和B细胞活性,rTB10.4对RAW264.7细胞的作用呈剂量依赖性,作用起效时间为12~24h,诱导作用在16~18h达到最大效应值。量化流式分析仪分析结果表明,rTB10.4刺激可显著增强RAW264.7细胞的细胞膜上TLR2的表达。

罗氏-ACEA非标记实时细胞分析技术专题讨论会在京举行

5月9日北京翠宫饭店，罗氏应用科学公司和ACEA Biosciences公司联袂举行了“非标记、实时细胞分析技术专题讨论会”。会议旨在通过对创实时细胞检测技术的介绍，及其在先进的基因分析平台上的应用讨论，提升整个生命科学研究及药物研发产量和质量。尽管基于细胞的检测技术目前已经被广泛应用；但由于实验过程中使用的标记和报告基因有可能会干扰研究状态下的多个生物学过程，

shRNA沉默HuR抑制肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移及侵袭能力

人抗原R (human antigen R,HuR)基因在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达。推测HuR基因也参与肝癌的发展过程。为探索HuR对肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭的作用,本研究通过蛋白质印迹实验,检测HuR在肝细胞癌细胞系和正常肝细胞中蛋白质的表达水平。结果显示,肝细胞癌细胞系SMMC-7721 HuR的表达量显著高于正常肝细胞HL-7702。合成特异性靶向HuR基因的shRNA,转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721,检测结果发现,HuR基因表达量下调90%。沉默HuR,实时细胞分析技术(real time cell analysis,RTCA)结果显示,细胞增殖能力降低55%,侵袭能力下降75%;细胞划痕实验结果显示,迁移能力下降80%;克隆形成实验中细胞克隆数减少85%;此外,在HuR敲低稳转肝细胞癌细胞系SMMC-7721细胞中过表达Bcl-2,其细胞学现象部分获得逆转。激光共聚焦扫描系统检测结果显示,Bcl-2主要定位于肝细胞癌细胞系SMMC-7721的核膜及胞质。蛋白质印迹法检测结果显示,沉默HuR,Bcl-2下调92%,Survivin下调55%,Twinst1下调69%,N-钙黏着蛋白(N-cadherin)下调48%,E-钙黏着蛋白(E-cadherin)上调1.5倍。以上结果表明,HuR可能通过调控定位于核膜及胞质上的Bcl-2来参与肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移、侵袭及克隆形成过程,HuR基因有望成为临床上治疗肝癌的一个新的潜在靶点。

临床常用中药制剂对OVCAR3细胞的药效学比较

目的比较临床常用中药制剂对OVCAR3细胞OVCAR3的药效学。方法以采用实时无标记细胞分析(RTCA)检测榄香烯注射液、参芪扶正注射液、艾迪注射液、复方苦参注射液、消癌平注射液、康艾注射液、康莱特注射液对OVCAR3细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用,JC-1检测上述药物对肿瘤细胞线粒体膜电位的影响,CCK8法检测它们对正常细胞系MRC-5的毒性作用。结果榄香烯注射液、消癌平注射液、复方苦参注射液、艾迪注射液抑制OVCAR3细胞增殖的IC_(50)值分别为(44.98±0.13)μg/mL、(258.78±6.53)mg/mL、(121.73±1.23)mg/mL、(51.73±0.51)mg/mL,中、高剂量榄香烯注射液有明显抑制OVCAR3细胞迁移的作用;除康莱特注射液外,其他药物都有一定程度抑制OVCAR3细胞侵袭的作用。榄香烯注射液、消癌平注射液在IC_(50)剂量下作用24 h后,可检测到线粒体膜电位的改变。榄香烯注射液、艾迪注射液IC_(50(MRC⁃5))/IC_(50(OVCAR3))均大于1。结论以OVCAR3细胞为对象时,榄香烯注射液抗肿瘤作用最好,其次是艾迪注射液。

基于实时细胞分析技术验证人诱导多能干细胞分化的心肌细胞毒性评价模型

目的:利用人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)联合实时细胞分析(RTCA)技术,建立hiPSC-CMs体外心脏毒性评价模型,并选用阳性化合物进行验证。方法:研究选用商业化来源的hiPSC-CMs,选用不同作用机制的心脏毒性药物:蒽环类抗癌药阿霉素(0.3、1、3μmol·L^-1)、K+通道阻滞剂多非利特(0.03、0.1、0.3μmol·L^-1)和E-4031(0.1、0.3、1μmol·L^-1)、Na+通道阻滞剂美西律(3、10、30μmol·L^-1)、多离子通道阻滞剂维拉帕米(0.1、0.3、1μmol·L^-1)和苄普地尔(0.3、1、3μmol·L^-1)、抗组胺药物特非那定(0.3、1、3μmol·L^-1)和西沙必利(3、10、30μmol·L^-1),分别给予hiPSC-CMs作用48 h,采用RTCA技术连续监测心肌细胞搏动的频率、振幅、细胞指数、搏动图谱等指标在给药前后的变化。结果:阿霉素对心肌细胞的抑制作用呈现时效和量效依赖性特点;多非利特显著降低心肌细胞搏动幅度及频率;E-4031为1μmol·L^-1时显著降低心肌细胞搏动频率,缩短振幅,而0.1、0.3μmol·L^-1时则对心肌细胞无影响;30μmol·L^-1美西律作用2 h内心肌细胞搏动频率相对空白对照组降低了66.4%,振幅缩短了60.7%,并导致心肌细胞搏动周期延长;苄普地尔浓度低于1μmol·L^-1时对心肌细胞无影响,3μmol·L^-1苄普地尔作用2 h导致心肌细胞搏动间歇性停搏,并伴随细胞活力轻微下降;维拉帕米作用2 h内各剂量组心肌细胞搏动频率分别增强了12.2%、13.1%、52.3%,而振幅分别降低了20.0%、61.7%、67.6%。0.3μmol·L^-1以上浓度的维拉帕米导致心肌细胞搏动骤停(3/9);特非那定浓度≥1μmol·L^-1时短时间内即导致心肌细胞间歇性搏动骤停;西沙必利短期作用2 h内显著降低心肌细胞搏动频率和幅度,10μmol·L^-1以上浓度的西沙必利持续抑制心肌细胞搏动频率。结论:hiPSC-CMs结合RTCA技术可用于预测药物的心脏毒性风险。

多壁碳纳米管致人肝癌细胞HepG2毒性及代谢酶表达变化

采用实时无标记细胞分析系统研究多壁碳纳米管(MWCNTs)对人肝癌细胞HepG2毒性作用,确定MWCNTs是否会影响肝脏代谢酶谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)和细胞色素P450亚酶CYP1A1的表达。利用0.12、0.25、0.5、1和2 mg/mL的MWCNTs处理HepG2细胞24、48和72h后,采用噻唑蓝比色法(MTT)测定MWCNTs对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用。利用实时无标记动态细胞分析(RTCA)系统动态监测不同剂量(0.25、0.5、1 mg/mL)MWCNTs对HepG2细胞生长的影响。细胞经MWCNTs处理48 h后,实时定量荧光PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测肝脏代谢酶GSTP1和CYP1A1的mRNA水平和蛋白水平的变化情况。结果显示MWCNTs可以抑制HepG2细胞的增殖,且呈一定的剂量和时间依赖性。实时无标记细胞分析法能够准确监测MWCNTs对细胞增殖的过程,并且能避免多壁碳纳米管材料对数据的干扰。经MWCNTs处理后的细胞中肝脏代谢酶GSTP1mRNA水平和蛋白水平上调,而CYP1A1的mRNA水平和蛋白水平显著下降。

基于实时细胞电子分析技术的复方丹参片质量评价研究

目的利用实时细胞电子分析技术(real-time cell-based assay,RTCA)检测不同浓度复方丹参片对细胞的影响,筛选出对复方丹参片反应灵敏、稳定且有明显浓度依赖的细胞株,为复方丹参片进行细胞生物效应的质量评价提供实验依据。方法采用RTCA分析复方丹参片对人脐静脉内皮细胞(Huvec)、大鼠心肌细胞(H9C2)和大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RA-VSMC)的影响,形成时间剂量依赖性细胞反应曲线,测定细胞指数,筛选最优的细胞株。结果3种细胞对复方丹参片的效应均有明显反应,RA-VSMC的灵敏度相对较差,3种细胞的有效浓度范围也有差异,浓度梯度依赖性也各有不同。H9C2细胞对复方丹参片具有良好的敏感度,呈浓度梯度依赖,且有效浓度范围为0.3~1.8 mg/ml,可作为复方丹参片质量评价的细胞。结论RTCA技术可实时监测记录细胞生长状态,准确反映复方丹参片对不同细胞株的影响,数据客观可靠,为复方丹参片的质量评价研究提供了新的实验技术和方法。

实时细胞分析技术结合模式识别评价祖师麻注射液类过敏反应

建立一种体外类过敏反应评价方法,快速评价不同厂家15批次祖师麻注射液的类过敏反应。采用体外嗜碱性白血病细胞株RBL-2H3细胞模型,选择Compound 48/80为阳性药,利用实时细胞分析(real-time cell analysis,RTCA)系统检测药物干预后引起的细胞指数(cell index,CI)变化,并利用甲苯胺蓝染色法观察细胞形态、骨架变化验证RBL-2H3细胞的脱颗粒情况。采用聚类方法对15批祖师麻注射液作用于RBL-2H3细胞后的CI进行分析。结果表明,Compound 48/80(20μg·mL-1)使细胞形态和细胞骨架均发生明显改变,发生明显的脱颗粒现象。CI在加药30 min内快速下降,之后下降趋势变缓,提示RTCA系统可以快速敏感地评价RBL-2H3细胞脱颗粒作用。15批祖师麻注射液对RBL-2H3细胞的CI结合聚类分析(CA),提示不同厂家的祖师麻注射液对RBL-2H3细胞影响不同,S1~S8与Compound 48/80组聚为一类,提示该样品可能潜在临床类过敏反应;S9~S15与空白对照组聚为一类,提示该样品无类过敏样反应。该研究建立了一套基于RTCA系统结合模式识别的类过敏反应体外快速评价技术,可用于中药注射剂类过敏反应的体外快速评价。

脐血来源NK细胞的体外扩增及其抗肿瘤细胞活性的研究

目的研究脐血单个核细胞来源NK细胞的培养方法及其对不同类型肿瘤细胞的杀伤活性。方法自脐静脉消毒后全封闭采集脐血,肝素抗凝,分离单个核细胞,用NK细胞培养基培养14 d,流式细胞仪检测其表面标志,并使用RTCA实时无标记细胞分析技术检测细胞增殖曲线,观察NK效应细胞按效靶比1:1、5:1与10:1对肿瘤细胞的杀伤作用。结果培养14 d的脐血单个核细胞,细胞总数扩增294倍,其中NK细胞扩增5580倍。NK细胞CD3^(-)CD56^(+)阳性率为97.93%,与杀伤功能相关的重要分子CD16、NKG2D、NKp30、NKp44的表达阳性率均在95%以上。对A549肺癌细胞株作用6 h的杀伤活性,在1:1~10:1效靶比范围内,随着效靶比增加,杀伤活性从(78.16±2.41)%逐渐增强到(95.71±3.21)%;并且在效靶比1:1的情况下,随着作用时间从6 h延长到24 h,杀伤活性也从(78.16±2.41)%逐渐增强到(96.33±2.15)%。结论建立了无需分选细胞、无需滋养层细胞、操作简单、通用性强的脐血NK细胞培养方法,获得的NK细胞纯度高,对肿瘤细胞的杀伤作用强。

罗氏xCELLigence系统：实时、无标记细胞分析检测技术

目前，大部分细胞检测方法采用的仍是传统的终点法——仅仅给实验定格了一个最终结果，而且经常需要标记和破坏细胞。这就是当前细胞分析方法的最大局限性，因为细胞是活体，其生物学和细胞效应过程应该是动态而非静态的。因此，为了更充分的了解和测量生物学和细胞效应，最理想的选择应当是使用一种对细胞无侵入性的系统，并能检测到细胞对某些刺激（如药物处理或某种生长因子刺激）应答产生的全过程动态反应信息。