TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测登革病毒

目的建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue Virus, DV)鉴定方法.方法根据DV 3'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针.利用1998～2004年收集的26份登革热病人临床血清标本,15例乙脑病人血清,DV 4个血清型标准毒株及23株1978～1997年DV 地方流行株和相关西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒等毒株,同时用克隆了1型DV 基因组3'端非编码区序列片段的质粒DNA作为阳性对照,检测所建立方法的特异性、敏感性.结果所建立方法的最低检测限约为每反应5个基因拷贝.用该方法检测4个血清型DV 标准毒株、23株DV 地方流行株和26例分离到DV 的阳性血清标本,检出率为100 %;用该方法检测15例乙脑病人血清、10例麻疹病人血清和西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒,结果均为阴性.结论新建的TaqMan MGB探针检测DV 方法是实验室早期诊断登革热较理想的方法.

Taq Man MGB探针实时聚合酶链反应检测白纹伊蚊体内登革病毒

目的初步研究TaqManMGB探针实时聚合酶链反应(TaqManMGBRealtimePCR)检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性,建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Denguevirus,DV)鉴定方法。方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den2型病毒,设不同的感染蚊虫浓度(只/500μl或只/1000μl)和不同的分组方法(不加未染毒的蚊虫、分别用未染毒的实验室饲养的雌性白纹伊蚊补加到每份标本10、25、50只/组),利用一步法和二步法TaqManMGBPCR检测,根据荧光信号判断结果。结果二步法TaqManMGBPCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为2只/500μl和3只/1000μl,一步法TaqManMGBPCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为5只/500μl,蚊自身的RNA对登革病毒RNA的检测敏感性并无明显的影响。结论TaqManMGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高,特异性好,是白纹伊蚊携带登革病毒指数较理想的监测方法,标本较好的处理方法为500μl标本处理液研磨20～30只/组,TaqManMGBRealtimePCR最好采用二步法。

实时聚合酶链反应检测慢性牙周炎患者巨细胞病毒临床分析

目的利用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测慢性牙周炎患者牙龈下巨细胞病毒DNA水平,探讨病毒感染水平与慢性牙周炎临床指标的相关性。方法采集慢性牙周炎患者30例(慢性牙周炎组)和无牙周炎患者20例(对照组)深牙周袋标本及牙龈下组织,记录慢性牙周炎组牙周袋探诊深度、附着丧失水平、牙龈指数等临床指标,PCR检测2组巨细胞病毒在深牙周袋及牙龈下组织中的基因表达。结果巨细胞病毒DNA在慢性牙周炎组深牙周袋检出率与对照组无统计学意义;在慢性牙周炎组,深牙周袋巨细胞病毒DNA检出率显著高于牙龈下组织(x^2=11.9154,P=0.0006),但巨细胞病毒DNA水平无统计学意义;慢性牙周炎组巨细胞病毒基因水平与牙龈指数,牙周袋深度和附着丧失水平均呈正相关。结论巨细胞病毒与慢性牙周炎牙周破坏程度相关,深牙周袋是其重要寄生部位。

实时聚合酶链反应

当Kary Mu11is设计聚合酶链反应（PCR）并使它于十九世纪八十年代的某一晚登陆加州海岸时，他根本就没有想象到这种方法会在分于生物学和医学遗传学的多个领域中变得如证重要。最初PCR技术由于缺乏精良的设备和试剂因而发展受到限制，但是没过多久，这种方法在几个小时内从少至单个细胞开始，扩增数十亿选择性脱氧核糖核酸（DNA）片段的能力，显然对于核酸研究和操作具有无法估量的价值。

实时聚合酶链反应方法检测人偏肺病毒的比较研究

人偏肺病毒(the human metapneumovims，hMPV)是2001年首次从荷兰儿童的鼻咽部吸出物中分离出来的，为一种负链RNA病毒，初步被归属于副粘病毒科偏肺病毒属。hMPV和流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、人呼吸道合胞病毒(hRSV)一样可导致儿童、成人及免疫功能受损患者的急性呼吸道感染(ARTI)。在儿童病原体不明的ARTI中，hMPV占1．5％-10％。但是。

不同激素处理下番茄实时荧光定量聚合酶链反应内参基因的筛选

为筛选出在不同激素诱导下番茄中较为稳定的内参基因,本研究以脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、水杨酸(salicylic acid,SA)3种外源激素分别诱导处理0、24、48、120 h的感病番茄品种‘Moneymaker’(MM)和抗病番茄自交系62579叶片为试验材料,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)进行扩增,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件分析EF1α、L33、Act、Ubi、GAPDH、UK、CAC、TIP41这8个番茄候选内参基因的表达稳定性。结果表明,8个候选内参基因的平均CT值为26~34。综合3个软件的分析结果发现,在ABA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为L33和Ubi;在MeJA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为L33和EF1α;在SA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为EF1α和L33。综上所述,L33基因是番茄在不同激素诱导下表达最稳定的候选内参基因。本研究筛选的最稳定内参基因将为后续番茄响应外源激素处理的差异基因表达分析和分子机制研究提供校准依据。

基于三重实时荧光聚合酶链反应构建黄牛和牦牛源性成分同步检测方法

目的建立一种拥有内源质控的三重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,用以快速鉴定肉和乳中黄牛和牦牛的源性成分。方法首先对黄牛肉、牦牛肉、黄牛奶、牦牛奶等7种动物产品进行特异性检测,同时通过稀释梯度方法验证此方法的绝对检出限(limit of detection,LOD),最后通过黄牛和牦牛肉掺假模拟试验确定该方法的相对灵敏度。结果该方法的特异性强,能特异性地检测到来源于黄牛和牦牛肉和乳的DNA,稳定扩增的内源质控有效地避免了假阴性结果,本方法针对黄牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10‒3 ng,针对牦牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10^(‒2)ng,本方法对黄牛肉和牦牛肉混合肉的相对灵敏度可达0.1%牦牛肉。结论所建立的三重实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高,可实现黄牛和牦牛源性以及内源质控的同步检测,又能通过内源质控排除实验假阴性结果。

实时荧光聚合酶链反应检测新型冠状病毒室内质控方法初探

目的绘制实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)定性室内质控图和基于循环阈值的Levey-Jennings质控图,探究新型冠状病毒RT-PCR检测的室内质控方法。方法使用无菌生理盐水按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40对第三方质控物进行倍比稀释,确定室内弱阳性质控的稀释倍数。统计该实验室2022年1-2月新型冠状病毒RT-PCR阴阳性质控原始记录,以自定义数值绘制定性结果散点图。统计2022年1-2月每批次弱阳性质控的靶基因Ct值,分别对N基因和ORF1ab基因两组Ct值进行正态分布检验,根据前20次检测结果分别计算N基因和ORF1ab基因的靶值X和标准差s,绘制Levey-Jennings质控图。结果确定1∶30为每日室内质控的弱阳性质控品的稀释倍数。定性检测散点图可直观发现1次弱阳性质控检出阴性的“假阴性”反应。弱阳性质控N基因、ORF1ab基因Ct值均符合正态分布(P>0.05)。N基因Ct值靶值X为34.13,变异系数为1.91%,所有Ct值均在X±3 s以内,5次出现±2 s警告,符合Westgard质控规则。ORF1ab基因Ct值靶值为35.30,变异系数为2.58%,出现1次+3 s失控,5次±2 s警告,第31~41批次违反了10x规则,第73~80批次违反了R 4s规则。结论应用定性室内质控散点图和Levey-Jennings质控图建立的新型冠状病毒室内质控方法具有可行性,能够有效监测和预警检测过程中的质量问题,保证检测结果准确可靠。

反转录酶在微小RNA实时荧光定量聚合酶链反应中的作用

目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。

实时荧光定量聚合酶链反应对乙型肝炎病毒DNA的检验效果

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对乙型肝炎(乙肝)患者进行乙肝病毒(HBV)DNA检验的效果。方法选择2020年9月—2022年10月在菏泽市第三人民医院进行健康体检的1000名受检者作为研究对象,其中500名纳入对照组,依托酶联免疫吸附法(ELISA)法对HBV-DNA开展检测操作;其余500名纳入观察组,运用实时荧光定量PCR法对HBV-DNA开展检测操作,比较两组HBV标志物[包括乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝炎e抗体(HBeAb)、乙肝核心抗体(HBcAb)]的检出率,分析不同阳性组合分布情况。结果观察组的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb检出率均明显高于对照组(HBsAg:1.40%比0.20%,HBsAb:1.80%比0.40%,HBeAg:1.80%比0.20%,HBeAb:1.20%比0.00%,HBcAb:1.40%比0.00%,均P<0.05)。观察组的大三阳(HBsAg、HbeAg、HbcAb均阳性)、小三阳(HBsAg、HbeAb、HbcAb均阳性)检出率均明显高于对照组(大三阳:1.60%比0.20%,小三阳1.40%比0.20,均P<0.05)。对照组和观察组HBsAg及HBcAb均阳性、HBsAg及HBeAg均阳性、五项均阳性的检出率比较差异均无统计学意义(HBsAg及HBcAb均阳性:0.20%比0.20%,HBsAg及HBeAg均阳性:0.00%比0.20%,五项均阳性:0.20%比0.40%,均P>0.05)。结论应用实时荧光定量PCR法开展对HBV-DNA的检测效果较为突出,有较高的准确度,与ELISA相比应用价值理想。

实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用

目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)方法并进行水体标本的检测评价。方法根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物,利用SYBR Green染料,建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT-PCR方法,对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价。采集河口水标本增菌后进行RT-PCR检测,与分离培养方法比较评价实际应用价值。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT-PCR方法,根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增;对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增;RT-PCR检测524份河口水体标本的增菌液,与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性,并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性。结论以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT-PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查。

实时聚合酶链反应技术检测妊娠晚期孕妇B族溶血性链球菌的多中心研究

目的探讨实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测妊娠晚期孕妇B族溶血性链球菌（group B Streptococcus，GBS）的准确性。方法本研究为多中心研究。选择2009年3月1日至12月31日在北京大学第一医院妇产科、首都医科大学附属北京妇产医院产科和北京大学第三医院妇产科产前保健的妊娠35～37周孕妇，取阴道下1/3分泌物及肛周分泌物，采用常规细菌培养法及实时PCR方法进行GBS检测。采用基因测序作为矫正方法，分析实时PCR方法检测GBS的敏感性和特异性。结果（1）3家医院共收集1395份标本，细菌培养法检测GBS阳性40例（2.9%），实时PCR方法检测GBS阳性114例（8.2%）。（2）仅实时PCR方法检测GBS阳性者77例，采用事先设计好的第2对引物扩增后进行测序，检测鉴定为GBS序列的共66例，11例为非GBS。（3）以细菌培养法加测序法校正作为金标准，实时PCR方法检测GBS的敏感性为97.2%（103/106），特异性为99.1%（1278/1289）。常规细菌培养法漏诊率62.3%（66/106）。（4）细菌培养法加测序法校正3家医院孕妇妊娠晚期GBS携带率为7.6%（106/1395）。结论实时PCR方法检测GBS具有较高的敏感性和特异性，有望成为妊娠晚期常规检测GBS的方法。

实时聚合酶链反应技术检测妊娠晚期B族溶血性链球菌的临床价值

目的：探讨实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测妊娠晚期孕妇B族溶血性链球菌（group B Streptococcus，GBS）带菌状态的价值。方法收集2013年5月至8月在解放军总医院产前检查的妊娠35～37周孕妇312例，采用实时PCR和细菌培养方法进行GBS检测（其中12例仅行细菌培养检测）。任意一种方法检测结果阳性判定为GBS阳性。对2种检测方法检测结果不一致者进行基因测序验证。采用χ^2检验比较2种检测方法的阳性率差异。结果单纯行细菌培养者12例，检测结果均为GBS阴性，另外300例孕妇同时行细菌培养和实时PCR检测。细菌培养法阳性率为1.3%（4/300），明显低于实时PCR的阳性率[7.7%（23/300）]（χ^2=12.57，P〈0.05）。共有25例孕妇GBS阳性，其中21例实时PCR阳性而培养阴性，2例实时PCR和培养均阳性，2例培养阳性而实时PCR阴性。总体阳性率为8.0%（25/312）。以培养结果作为金标准，实时PCR检测的灵敏性为2/4，特异性为92.9%（275/296），阳性预测值为8.7%（2/23），阴性预测值为99.3%（275/277）。结论实时PCR技术可提高GBS的检出率。

牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒（NV）定量分型诊断方法。方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析，设计高度特异的引物和探针，建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法（TaqMan Real—time RT—PCR）。结果 该方法对NV核酸检测高度特异，且GI和GⅡ型之间无交叉反应，最低检出限达10^2 copies／ul。对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT—PCR和笔者建立的TaqManReal—time RT—PCR进行NV检测，发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者，而粪便标本中两者无明显差别。同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠。结论 研究中建立的TaqMan Real—time RT—PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测，可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法。

实时荧光定量聚合酶链反应技术在肾结核病理诊断中的应用价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术在肾结核病理诊断中的应用价值。方法回顾性收集我院泌尿外科通过后腹腔镜技术或开放技术行肾切除术后石蜡组织标本55例患者的临床资料,以术前尿结核分枝杆菌培养结果为金标准,并结合术后病理诊断结果,将研究对象分为结核肾病组25例(阳性组),非结核肾病组30例(阴性组)。采用Taqman探针法实时荧光定量PCR技术和抗酸染色技术检测每个石蜡组织标本,对比分析两种检测技术在肾结核病理诊断中的诊断效能,绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估两种方法在肾结核病理诊断中的价值。结果实时荧光定量PCR技术检测的敏感度与抗酸染色技术检测的敏感度分别为80.0%(20/25)和48.0(12/25),前者相比后者敏感度提高了32.0%,差异有统计学意义(χ^(2)=5.556,P=0.018)。荧光定量PCR检测的特异度、阳性预测值、阴性预测值均高于抗酸染色检测的结果,但两者比较差异均无统计学意义(P>0.05)。荧光定量PCR检测的准确度高于抗酸染色检测的准确度(89.1%vs.72.7%),两者比较差异有统计学意义(χ^(2)=4.767,P=0.029)。两种技术检测肾结核组织标本病原体结果与尿结核分枝杆菌培养结果的一致性Kappa值分别为0.777和0.429。ROC曲线分析显示,实时荧光定量PCR技术和抗酸染色技术的ROC曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.883和0.707,前者高于后者0.177,差异有统计学意义(Z=3.502,P<0.05)。结论实时荧光定量PCR技术检测方法简单易行,与抗酸染色检测技术相比可以提高肾结核组织病原体检测的敏感度和准确度,在肾结核的病理诊断中具有良好的应用价值。

实时聚合酶链反应检测切割穹窿海马伞大鼠海马内磷脂酰乙醇胺结合蛋白mRNA的表达变化

目的探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)mRNA的表达差异。方法42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹隆海马伞后1、3、7、14、21及28d组,每组6只。提取各组大鼠的海马组织总RNA,应用实时PCR技术观察切割穹窿海马伞后海马中PEBPmRNA的表达变化。结果PEBPmRNA在切割后3d表达开始上升,7d达最高水平,随后缓慢下降,21d时降至正常。结论切割穹窿海马伞后海马中PEBP的高表达可能与诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化的海马神经再生有关。

实时荧光聚合酶链反应技术在献血者血液筛查中的应用

目的评估将实时荧光聚合酶链反应技术应用于血液常规筛查的必要性。方法使用实时荧光聚合酶链反应技术对酶免双试剂及转氨酶检测合格的无偿献血者血液标本进行核酸筛查，初筛阳性标本进行病毒项目确认。确认阳性标本进一步做病毒载量和血清标志物检测。结果19562人份酶免阴性标本中共检出12份HBVDNA阳性标本，病毒载量为（〈12～30．6）IU／mL。其中5份为乙肝隐匿性感染，3份为乙肝感染恢复期，2份为变异病毒感染，2份为疑似乙肝窗口期感染。结论将实时荧光聚合酶链反应技术应用于血液筛查有利于提高成都地区输血安全，特别是对检出ELISAHBsAS阴性的低浓度乙型肝炎感染者具有重要意义。

应用实时荧光聚合酶链反应技术与第二代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒

目的比较实时荧光聚合酶链反应(PCR)与第2代杂交捕获法(HC-Ⅱ)2种人乳头瘤病毒(HPV)检测方法。方法采用实时PCR与HC-Ⅱ分别检测223例宫颈脱落细胞标本中的高危亚型HPV,对结果不一致的标本进行测序分析。结果实时PCR和HC-Ⅱ2种方法检测高危亚型HPV的一致性较好,总符合率为77%,总一致性指数(Kappa指数)为0.538。其中,高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组二者的符合率为82%,Kappa指数为0.410,一致性比其他组好。结论实时PCR与HC-Ⅱ检测结果一致性较好,尤其对于HSIL患者,可作为临床上HPV高危亚型检测的有效手段。

实时定量聚合酶链反应的研究及应用(综述)

实时定量聚合酶链反应(real-timequantitativePCR,RQ-PCR)是综合PCR、分子杂交和酶动力学的一种新技术,它根据荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytranslation,FRET)的原理进行.目前已经成功地开发出TaqManTM、molecularbeaconprobe、amplifluortechnologies、LightCycler和single-labeledprobe几种相关的技术,并广泛地应用于病毒学、遗传性疾病和肿瘤等方面的诊断检测.实验研究表明:RQ-PCR作为一种快速、准确的核酸检测方法,在临床及生物学研究方面均具有相当的实用价值.