实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.

应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性

目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。

复合探针实时荧光RT-PCR法检测小儿上呼吸道感染甲型流感病毒的价值

目的 分析小儿上呼吸道感染甲型流感病毒应用复合探针实时荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测的临床价值。方法选择2023年1月至2023年12月流感监测信息系统两家监测点上呼吸道感染甲型流感病毒感染的患儿80例监测标本进行回顾性分析,均开展复合探针实时荧光RT-PCR法检测,分析其诊断价值。结果 根据监测标本最终诊断结果显示,阳性标本68例、阴性标本12例。经复合探针实时荧光RT-PCR法检出67例,检出率为83.75%,敏感度为95.59%、特异度为83.33%、准确度为93.75%、阳性结果预测值为97.01%、阴性结果预测值为76.92%;批间批内变异系数均小于5%。结论 小儿上呼吸道感染甲型流感病毒应用复合探针实时荧光RT-PCR技术具有较高的敏感度、特异度及准确度,且检查结果快速,可为小儿上呼吸道感染甲型流感病变提供可靠的诊断,有利于制订合理的治疗方案。

半巢式反转录实时荧光PCR检测马铃薯黑环斑病毒

本研究根据基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式反转录实时荧光PCR检测PBRSV的新方法。该方法采用E.Z.N.ATM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式反转录实时荧光PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达300fg/μL植物总RNA。

盐胁迫下构树DREB转录因子基因表达的实时荧光定量PCR分析

转录因子是指那些专一性地结合于DNA特定序列上、能激活或抑制其他基因转录的蛋白质（王少峡等,2004）。DREB（dehydration responsive element binding protein）转录因子是一种特异性的转录因子,当植物在干旱、低温及盐等逆境胁迫下,

反转录实时定量PCR在植物基因表达分析上的研究进展

近年来,反转录实时定量PCR作为一项新的核酸序列定量分析技术以其定量准确、高灵敏度和高通量等特点,已被广泛的应用于分子诊断、病理分析以及食品安全检测等方面。然而其在植物基因表达水平研究上的报道较为少见。在前人研究基础上,总结了反转录实时定量PCR在植物基因综合表达分析、基因家族表达分析、基因差异表达分析、转基因表达分析等方面的应用;分析了反转录、看家基因选择等影响检测基因表达的因素;指出该技术在重复性、灵敏度、标准化上所存在的问题。随着分子生物技术的发展,反转录实时定量PCR将会在植物遗传育种、植物病理检疫以及分子进化等方面发挥更为广泛的作用。

新城疫强毒特异性反转录荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种敏感性高、特异性强、成本更低的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)特异性反转录荧光定量PCR(reverse transcription fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法,基于对所有已知NDVF基因序列特征的分析,设计了一对强毒特异性引物,以体外转录制备的RNA标准品为阳性模板,构建了标准曲线,并对该方法的敏感性、特异性和准确性进行了验证。结果表明,基于SYBRGreenⅠ嵌合荧光技术建立的检测方法能够特异性扩增NDV强毒,最低可检测1拷贝/μL的RNA,用于临床毒株的检测结果与序列测定一致,可作为适合大规模监测NDV强毒的方法和工具。

逆转录实时荧光定量PCR检测p73 mRNA在结肠癌的表达

目的:建立一种实时定量PCR方法检测p73mRNA的表达水平,探讨其与结肠癌发生、发展的可能关系。方法:采用SYBRGreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR检测39例结肠癌组织和其癌旁组织中p73mRNA的表达。结果:p73基因在结肠癌肿瘤组织的表达水平高于其在癌旁组织的表达(P<0.01);表达水平与肿瘤的恶性程度、分化及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:p73的高表达可能与结肠癌的发生、发展及预后有联系。

荧光实时逆转录PCR定量研究进展

荧光实时逆转录PCR广泛应用于稳态mRNA水平的定量 ,并且它已经成为基础研究、分子医学和生物技术的一种必不可少的实验工具。用此技术定量具有范围宽、敏感性高、精确度高 ,无PCR后处理步骤 ,避免了交叉污染 ,且产出率高 ,可以进行多重检测等特点。然而要成功地应用该技术并不是一件容易的事。现对方法学建立、扩增效率以及标准化等方面作一综述。

实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测HLA-DRα基因mRNA表达

目的建立实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HLA-DRα基因mRNA表达。方法应用T-A克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体作为标准模板,采用荧光Taqman方法及探针标记技术,建立实时荧光定量RT-PCR方法,制备标准曲线,检测牛膝多糖(ABPS)诱导人外周血单核细胞的HLA-DRαmRNA表达水平变化,并与半定量RT-PCR检测结果进行比较。结果实时荧光定量RT-PCR检测ABPS诱导人外周血单核细胞实验组HLA-DRαmRNA表达明显升高,而无ABPS诱导人外周血单核细胞对照组HLA-DRαmRNA表达没有改变,且半定量RT-PCR结果显示HLA-DRα出现类似的变化趋势。结论所建立的实时荧光定量RT-PCR用于检测HLA-DRαmRNA表达,结果用拷贝数表示,比半定量RT-PCR更灵敏、准确。

实时荧光定量PCR检测端粒酶逆转录酶mRNA在急性白血病中的表达

目的研究人类端粒酶转录酶（hTERT）在急性白血病的表达和意义。方法应用实时定量PCR（Real-time PCR）技术检测30例急性白血病骨髓单个核细胞及25例正常人骨髓单个核细胞中hTERT mRNA的表达水平，分析其表达水平与急性白血病恶性程度的关系。结果hTERT在急性白血病细胞中的中位表达量为0．00244（0～0．0320），明显高于正常人骨髓单个援细胞中hTERT的中位表达量2．79×10^-4（0～0．0078）（P〈0．001）。但在ANLL和ALL细胞中对比表达无明显差异（P=0．742）。结论在急性白血病中hTERT明显高于正常对照，hTERT是急性白血病诊断的特异性指标之一。

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NLRP3。以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。通过反应条件优化,成功建立了检测NLRP3基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示,所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因,建立的实时荧光定量PCR对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好,标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系。与对照组相比,NLRP3分子在FAdV-4感染鸡肝和脾中的转录水平极显著高于对照组(P<0.001),在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组(P<0.01)。本研究所建立的鸡NLRP3基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可以检测FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3的转录水平;致病性FAdV-4感染所造成的组织炎症损伤与NLRP3分子密切相关。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平

目的运用荧光定量反转录PCR技术,检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平。方法以基因型为(αα/αα)的新生儿作为正常对照组,基因型为(--/αα)的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因,ζ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ζ珠蛋白mRNA的转录水平。结果病例组的ζ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为(--SEA/αα)的新生儿的ζ珠蛋白mRNA转录水平的增高,具有较好的诊断价值。

茎-环反转录实时PCR技术分析miR-93和miR-342在乳腺癌细胞系中的表达

目的:应用高灵敏度的特异性茎-环反转录实时PCR技术检测分析小的非编码分子miR-342和miR-93在乳腺癌细胞中的表达。方法:用miR特异性试剂盒(miRNeasy Mini Kit)提取了总RNA和miRNA,进行特异性茎-环反转录和实时PCR(stem-loop reverse transcription real-time PCR,stem-loop RT-qPCR),检测miR-342和miR-93在5种乳腺癌细胞中的表达,并进行比较分析。结果:用高灵敏度的特异性茎-环反转录实时PCR技术检测发现miR-93在T47D细胞系中呈非常高的表达,BT-549和MCF7细胞系中呈相对高表达,在MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞系低表达;而miR-342在MCF7中呈非常高的表达,MDA-MB-231,BT-549和T47D中呈相对低表达,在MDA-MB-435中表达特别低。结论:miR-93和miR-342的表达在某种程度上与乳腺癌细胞高侵袭性呈一定负相关,表明miR-93和miR-342可能是乳腺癌的抑癌基因并可能具有抑制其转移的作用,为深入分析miR-93和miR-342抑制乳腺癌转移的作用机制奠定了基础。

反转录酶在微小RNA实时荧光定量聚合酶链反应中的作用

目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。

阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区(ITS)基因和外膜蛋白A(OmpA)基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。

人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。

诺如病毒遗传组I型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR的研究

目的建立诺如病毒遗传组I型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR快速、特异、灵敏的检测方法,为疾病预防控制提供可靠的依据。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅰ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立一步法实时荧光RT-PCR快速检测反应体系,优化反应条件,评价反应体系的灵敏度、特异性、重复性,并与常规RT-PCR比较。结果诺如病毒遗传组Ⅰ型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR检测时限短,仅1h就出结果,与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒、诺如病毒遗传组Ⅱ型无交叉反应,最低检出下限为100拷贝/反应,比常规RT-PCR灵敏100倍,5份浓度不同的诺如病毒遗传组Ⅰ型标本重复检测5次,平均Ct值变异系数范围为0.39%～1.02%。结论诺如病毒遗传组Ⅰ型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR快速、特异、灵敏、重复性好,可应用于突发公共卫生应急检测和诺如病毒遗传组Ⅰ型监测,提高快速检测能力。