SMN_1基因实时荧光定量分析在脊髓性肌萎缩携带者检测中的应用

目的脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy,SMA)是以脊髓前角运动神经元退化变性为特征的一种常见的常染色体隐性遗传病。SMA的发病率为1/10000,携带者频率为1/50,因此,对于运动神经元存活基因(survival motor neuron,SMN1)缺失携带者的检测在遗传咨询中尤为重要。然而SMA位点的重复使得携带者的检测比较困难。该研究的目的是探讨SMN1基因定量分析在SMA携带者检测中的作用。方法应用TaqMan技术的实时荧光定量PCR方法对109例不同临床表型的SMA患者父母和40例正常对照者的SMN1基因拷贝数进行检测。结果①SMA肯定携带者的SMN1基因的平均拷贝数为0.777±0.035,变异系数(CV)值4.5%;正常人(1例,用于验证检测方法的重复性)SMN1基因的平均拷贝数为2.064±0.120,CV值5.8%;②SMA患者父母SMN1基因平均拷贝数为0.798±0.108,CV值13.5%;正常人(38/40,为人群SMN1拷贝数)SMN1基因平均拷贝数为2.106±0.18,CV值8.5%。结论SMA患者父母和正常对照者的SMN1拷贝数的分布不同,前者为1个拷贝的SMN1基因;后者以2个拷贝的SMN1基因为主。因此,SMN1基因定量检测可用于区分大部分正常人和SMA携带者。

适宜当归实时荧光定量分析的总RNA提取方法研究

为了有效消除次生物质、多糖和多酚类物质的严重干扰,获得高质量适宜于实时荧光定量分析的当归总RNA,本研究采用CTAB法、试剂盒法和Trizol法分别提取当归根、茎、叶组织的总RNA,并通过紫外可见光分光光度计、非变性琼脂糖凝胶电泳和反转录荧光定量PCR检测总RNA的纯度、产率、完整性及质量。结果表明:CTAB法提取的当归根、茎、叶组织总RNA纯度较高、完整性较好且叶组织总RNA得率较高;试剂盒法所提的总RNA完整性亦较好,但纯度略差且各组织的得率均较低;Trizol法提取的茎组织总RNA能满足荧光定量PCR要求,但提取的根和叶组织总RNA均出现严重污染,无法满足后续研究要求。因此,CTAB法是一种经济、可靠、适宜当归实时荧光定量分析的总RNA提取方法。本研究结果为今后有效开展当归分子生物学研究奠定了方法学基础,也为其他药用植物总RNA的提取提供了参考。

实时荧光定量RT—PCR定量分析mRNA表达水平原理及应用

实时荧光定量RT—PCR技术是一种新近发展起来定量检测mRNA表达水平的灵敏方法。本文介绍了目前应用的四种荧光定量RT—PCR反应系统：即水解探针、杂交探针、DNA—染料结合和分子灯标RT—PCR反应系统，并对实时荣光定量RT—PCR反应系统的实验设计原则及所需仪器进行了介绍。

马尾松PmPIN2基因的克隆及实时定量分析

PIN2基因在植物生根机理中起关键作用,对马尾松PIN2基因进行研究,可为解决马尾松无性系生根困难、促根壮苗培育提供帮助。本研究以马尾松幼苗全株为试材,利用PCR技术和RACE技术克隆了马尾松PIN2基因全长,并通过相关软件和实时荧光定量进行生物信息学和组织特异性分析。结果发现PIN2基因全长3 706 bp,包括2 103 bp完整ORF序列,编码700个氨基酸。生物信息学分析表明,PIN2蛋白为疏水性蛋白,相对分子量76.43 k D,等电点(p I)为9.06,总亲水性平均数0.023,PmPIN2编码的蛋白与PIN家族具有同样典型结构域。实时荧光定量分析结果显示,PmPIN2基因在马尾松根、茎、叶、花中均有表达,其中根中的表达量最高,花中最低。PIN2基因是参与植物生根过程的重要基因,对马尾松PmPIN2基因的研究为PIN基因家族在生根机制方面的作用探究提供帮助。

谷子SBP转录因子家族基因的表达分析

SBP(Squamosa promoter binding protein)是植物中一类特有的转录因子,在调控株型建成、开花、产量、激素信号转导、逆境响应等方面发挥重要作用。为探究谷子SBP家族基因的表达模式,利用生物信息学和荧光实时定量PCR,对19个SiSBPs在不同组织器官中的表达模式进行了分析,并对其启动子顺式作用元件进行预测,进一步分析了7个SiSBPs对3种植物激素和3种逆境胁迫的响应规律;同时,利用psRNATarget server对miR156和miR529的靶基因结合位点进行了预测。结果表明,SiSBP17总体表达水平低于其他基因,SiSBP19表现为组成型表达,其余SiSBPs表现出明显的组织表达特异性;7个SiSBPs对生长素、赤霉素、茉莉酸甲酯等外源植物激素和ABA、冷、干旱等胁迫处理均有响应,不同基因在不同激素和逆境胁迫下的响应规律存在差异;另外,研究预测到13个SiSBPs存在miR156和miR529结合位点。

新生儿B族溶血性链球菌拷贝数与母婴感染的相关性

目的:研究B族溶血性链球菌(Group B Streptococcus,GBS)的定量分析与母婴感染的相关性。方法:应用实时荧光定量PCR技术,在孕周35~37周对孕妇进行GBS检测,并对新生儿进行GBS检测,结合临床病例诊断信息,研究母婴GBS感染情况。结果:共检测孕妇27462例,其中1139例为GBS阳性;阳性孕妇分娩的的新生儿中,有28例为GBS阳性。母婴共同感染有28例。当新生儿GBS拷贝数≥104时,患儿表出现感染或异常体征。随着母亲GBS拷贝数升高(102~109),新生儿GBS拷贝数≥104的比例存在增高的趋势。结论:新生儿所携带GBS拷贝数多少对新生儿感染有影响,且与母亲GBS拷贝数的量呈正相关,临床应采用定量分析方法检测新生儿GBS感染。

棉花内切-β-1,4-葡聚糖酶(EG17)基因的克隆及生物信息学分析

EG17基因在植物器官的的脱落过程中发挥一定作用。根据已公布的拟南芥EG17基因序列的CDS设计引物,从陆地棉‘新陆早50号’中克隆一个同源基因GhEG17(Endoglucanse 17-like,GenBank登录号:NM_001327069.1)核苷酸序列,并利用qRT-PCR技术研究脱吐隆悬浮剂(TDZ)处理后叶托组织中GhEG17基因的表达模式。结果表明,获得的GhEG17基因开放阅读框(ORF)为1533 bp,编码510个氨基酸。通过结构域分析,发现Gh EG17中含有一个GH9家族特有的保守域结构,是GH9家族基因所特有的Glyco_hygro_9(GH9)结构域。GhEG17蛋白二级结构预测显示,α-螺旋占27.65%,延伸链占20.00%,无规则卷曲占52.35%。系统进化树分析结果表明GhEG17和GaEG17亲缘关系较近。qRT-PCR表明,GhEG17基因在‘新陆早50号’和‘XND1378’棉花6个时期棉花叶托组织中的表达量均在18 h中最高,但在品种‘新陆早50号’响应TDZ处理诱导胁迫比‘XND1378’更强烈。利用基因工程技术挖掘并利用棉花脱落相关基因,培育转基因机械采收棉花新品种,以促进机采棉育种的不断完善,具有十分重要的理论价值和现实价值。