便携式实时荧光定量PCR仪数据处理方法研究

实时荧光定量PCR越来越多被用来定量核酸的表达水平,随着经济与社会的发展进步,个人的自我保护意识和自身健康都重视了起来,使得人们对健康有了更高的要求,适应于现场核酸分析技术的需求日渐显著,不同的仪器有不同稳健的、合适的测量分析方法。本研究针对一种基于转盘式荧光检测的便携式实时荧光定量PCR仪的数据进行处理分析,通过对比优化不同峰值拟合算法及扩增曲线拟合算法优化提升了光学系统检测性能。结果表明,针对该系统峰值拟合算法采用正弦拟合对原始数据进行处理有较好的效果,扩增曲线拟合算法采用4参数logistic拟合,标准品浓度梯度样本扩增结果线性拟合优度R^(2)>0.990,变异系数CV值小于5%,使得光学系统检测性能有所提升,为该类检测模型仪器的数据处理方法提供了一定参考。

ABI 7300实时荧光定量PCR仪的性能评估

目的为参加医学实验室认可和评价仪器性能,对ABI 7300实时荧光定量PCR仪的性能进行评估。方法参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）文件对ABI 7300荧光定量PCR仪检测HBV-DNA定量结果的精密度、正确度、灵敏度及线性进行评价。结果精密度：批内变异系数（CV批内）为2.38%-4.61%,批间变异系数（CV批间）为3.87%-5.33%,达到《医学实验室质量和能力认可准则》中基因扩增检验项目分析性能标准（CV批内〈4.8%,CV批间〈6.4%）。正确度：参加2011年卫生部室间质评结果总体平均偏倚为2.14%,符合卫生部质评要求（偏倚不超过8%）;功能灵敏度：100IU/mL检测限浓度的CV值最接近于20%,与试剂盒检出下限相符;线性：相关系数（r2）为1.0,线性关系符合要求。结论 ABI 7300实时荧光定量PCR仪各项性能指标精确,可以为临床提供快速、准确的报告。

实时荧光定量PCR仪检测HBV DNA的性能验证及评价

目的验证ABI step one plus实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测系统的性能。方法参考ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则(2012年)》以及美国临床实验室标准化协会(CLSI)文件,对临床检验使用的实时荧光定量PCR检验系统的精密度、准确度、可报告范围、定量检测限等进行验证与评价。结果精密度:高、低两个水平的血清标本批内变异系数(批内CV)分别为3.83%、4.25%,批间变异系数(批间CV)分别为2.63%、3.46%。准确度:2019年室间质评得分100分,准确度良好。可报告范围:检测试剂在2.51×102~3.11×108 IU/mL线性良好,线性回归方程为Y=1.0132 X+0.0192,R 2=0.997。系统定量检测限为200 IU/mL。该室2019年10—12月测定的室内质控品结果的累积均值为4.16 IU/mL(log值),x±2 s范围为3.91~4.40 IU/mL(log值),符合参考范围。结论该实验室HBV DNA检测系统性能良好,适用于临床常规检测。

iQ^(TM)5多重实时荧光定量PCR仪应用及使用方法

实时定量PCR(real-time quantitative PCR)通过连续监测PCR扩增指数期间荧光信号强弱变化反应特异性的表达量,并据此计算出目的基因的表达量。此方法不需要分离PCR产物并作为极有效的实验方法,目前已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。本文主要介绍iQ^(TM)5型荧光定量PCR仪的原理及组成并以植物材料为例,分析介绍仪器的性能、使用方法及操作过程中的注意事项。

IQ^TM5多重实时荧光定量PCR仪快速检测肠道病毒RNA及其临床意义

目的应用实时荧光定量法快速检测肠道病毒RNA，为手足口病的早期诊断提供临床依据。方法采用实时荧光PCR法检测手足口病患儿粪便、咽拭子中肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组16（CA16）和肠道病毒71型（EV71）RNA。结果332份标本中肠道病毒通用型阳性304例．检出率为9157％；CA16阳性132例，阳性率为39.76％；EV71阳性135例，阳性率40．66％，其中有2例同时捡出CA16和EV71。结论实时荧光定量PCR能对肠道病毒RNA进行快速检测，为手足口病的早期诊断提供诊断依据，并对手足口病患儿的病情分析、治疗及预后观察起到指导作用。

实时荧光定量PCR仪原理与技术关键点分析

本文主要阐述实时荧光定量PCR技术的基本构成、测量原理,以及实时荧光定量PCR仪的部件构成、质量控制和影响其检测精密度的因素。

ABI7300实时荧光定量PCR仪性能评价

目的评价ABl7300实时荧光定量PCR仪的性能。方法按照学实验室质量和能力认可准则（CNAs）》，分别对临床血清、质控物进行HBV—DNA定量检测，分析评价其精密度、灵敏度、准确度、线性和仪器可比性。结果精密度：c批间：3．7％～4．4％、CV批内：2．1％～3．7％和CV总：2．9％～4．1％；准确度：其测量值与预测值的相对偏差均〈3％；灵敏度：其检测1000IU／mL的检出率为98％；线性：直线回归方程为Y=1．275X～0．07，相关系数为r=0．998；与德国罗氏Lightercylcer1．2实时荧光定量PCR仪的可比性：r=0．997，Y=0．824X＋0．416。结论ABl7300实时荧光定量PCR仪各项性能指标均良好，与德国罗氏LightCyclerl．2检测系统有较高的相关性，值得实验室应用及临床推广。

一种基于熔解曲线的实时荧光定量PCR仪校准方法

针对实时荧光定量PCR仪光学校准方法的不完善,通过对实时荧光定量PCR仪校准必要性、基本结构和数学原理的分析,基于熔解曲线从C_t值均匀度、C_t值精密度、通道峰值高度一致性、线性灵敏系数、熔解温度漂移和熔解温度比等方面对实时荧光定量PCR仪校准方法进行分析。

地方院校实时荧光定量PCR仪的购置与使用管理

为了充分掌握地方院校实时荧光定量PCR仪实际情况,为设备主管部门制定管理对策,提供基础参考依据,重点对单价10万元及以上实时荧光PCR仪进行了调研。从设备购置、管理人员、设备管理和使用效益4个方面,详细分析了该设备在地方院校中的实际状况,找出了该设备的优势和薄弱环节,得出了相应的结论。

探讨实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析

目的探讨与分析实时荧光定量PCR仪用于流感病毒中的应用效果。方法搜集2018年10月至2019年3月期间对我市哨点医院在流感流行期疑似流感病毒样本共530例作为检测对象,依据检查方案不同分配成参照组(细胞培养法)及实验组(实时荧光定量PCR法),统计两组检测方法阳性检出率及实施荧光定量PCR灵敏度及特异性情况,并予以分析和总结。结果通过对530例疑似流感病例中实验组检测出阳性样本共89份,其中检出新甲H1型71份、H3亚型14份、B型4份;参照组分离毒株57株,其中新甲H1型52株、H3亚型3株,B型2株,各组均未检出H5、H7、H9亚型。则研究组与参照组呈正相关,且新甲H型、H3型、B型与毒株分别呈正相关,P<0.05;实验组流感病毒阳性率为89(16.79)%,参照组流感病毒阳性率为57(10.75)%,差距明显(P<0.05)。结论采用实时荧光定量PCR技术可对流感病毒的特异性及灵敏度更高,可作为首选的检测方法。

晶芯~RT-Cycler636实时荧光定量PCR仪

仪器简介：博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心自主研发的晶芯@RT-Cycler636实时荧光定量PCR仪是致力于生命科学研究和分子诊断应用领域的新型产品。它采用离心式实时荧光检测方式，通过热循环PCR对特异性的靶基因进行扩增并定量。该仪器具有适用范围广，准确性高，体积小巧，操作简便等特点。

实时荧光定量PCR仪用于流感病毒检测的效果分析

目的:探讨流感病毒检测中应用实时荧光定量PCR仪的价值。方法:选取2022年1月~2023年12月本中心采集检测的129份急性上呼吸道感染者的咽拭子标本展开研究,采集标本后实施实时荧光PCR仪、胶体金法测定标本中流感病毒核酸,分析两种方案检出情况、诊断效能。结果:实时荧光定量PCR仪阳性率19.38%,胶体金法阳性率为14.73%,实时荧光定量PCR仪检测阳性率高于胶体金法(P<0.05)。实时荧光定量PCR仪特异度(99.02%)、灵敏度(92.59%)、准确率(97.67%)高于胶体金法(P<0.05)。结论:在流感病毒检测中应用实时荧光定量PCR仪准确率、敏感度较高,且该方案可以迅速且有效检测出流感病毒核酸,为迅速地采取有效的疫情防控措施提供依据。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。

低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。

在生物科学综合实验引入实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过教学实践,取得了良好的效果。学生不仅掌握了扎实的实践技能和前沿的科研方法,还提高了数据分析与处理的能力。

荧光定量PCR仪校准技术指标及结果分析

根据不同荧光定量PCR仪器品牌的市场占有率挑选了不同型号、不同工作频率和使用年限的仪器进行校准和质量风险分析,重点针对温度示值误差、温度均匀度、样本重复性和样本线性四个技术指标作了检测和比较,探讨了这四个技术指标出现偏差可能造成的检测结果失准的风险,并对仪器生产厂商和仪器使用者提出了建议。通过分析评估得出了该类仪器应该重点关注的技术参数指标和技术难点,为仪器使用者了解该产品的质量状况及相关政策措施的制定提供了参考依据。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

6种不同实时荧光定量PCR仪对新型冠状病毒核酸检测性能的影响探讨

目的:探讨6种不同型号的实时荧光定量PCR仪(分别为CFX96 DeepWell、GENTIER 96E、Cobas z480、LightCycler 480Ⅱ、ABI 7500、QuantStudio 5,依次标为A、B、C、D、E、F)对新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测性能的影响,以便选择分析性能佳的检测系统用于临床检测。方法:应用2019-nCoV阴性混合鼻咽拭子样本将商品化2019-nCoV RNA液体室内质控品(假病毒)先10倍稀释接着2.5倍梯度稀释至1∶10、1∶25、1∶62.5、1∶156.25、1∶390.63、1∶976.56、1∶2 441.41和1∶6 103.52八个不同浓度,连续3 d内每天每个浓度做5个复孔,共计15个复孔,磁珠法提取核酸后应用同一种2019-nCoV扩增试剂在6种不同实时荧光定量PCR仪上进行扩增以评价其检出限;将1∶10和1∶25两个稀释度的质控品样本,连续5 d内每天每个浓度做5个复孔,共计25孔,磁珠法提取核酸后应用同一种2019-nCoV扩增试剂在6种不同实时荧光定量PCR仪上进行扩增以评价靶基因循环阈值(Ct)的重复性和实验室内精密度。结果:(1)6种实时荧光定量PCR仪对1∶10、1∶25和1∶62.5三个稀释度的质控品样本中ORF1ab和N基因的检出率均为100.0%;而对1∶156.25稀释样本中ORF1ab和N基因的检出率:仪器A为100.0%和100.0%,B为66.7%和86.7%,C为100.0%和100.0%,D为93.3%和93.3%,E为93.3%和93.3%,F为100.0%和100.0%;对1∶390.63稀释样本中ORF1ab和N基因的检出率:仪器A为60.0%和86.7%,B为60.0%和80.0%,C为66.7%和73.3%,D为73.3%和93.3%,E为66.7%和53.3%,F为73.3%和93.3%;1∶976.56、1∶2 441.41和1∶6 103.52三个稀释度的质控品样本中靶基因的检出率分别为4.00%~60.00%、6.67%~20.00%和0~20.00%。(2)6种不同实时荧光定量PCR仪对1∶10和1∶25两个稀释度的质控品样本中Ct的重复性和实验室内不精密度均<5.00%。结论:不同的实时荧光定量PCR仪对2019-nCoV核酸检测性能存在影响,该2019-nCoV扩增试剂在仪器C、F上的分析灵敏度优于另外4种实时荧光定量PCR仪。