细菌培养法、免疫层析法及实时荧光定量PCR法在孕晚期B族链球菌筛查中的应用对比研究

目的:研究细菌培养法、免疫层析法及实时荧光定量PCR法在孕晚期B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS)筛查中的应用价值。方法:选取2021年3月至2023年5月在我院接受产检的孕晚期孕妇154例。以病理活检为金标准,分析GBS筛查结果;对比细菌培养法、免疫层析法及实时荧光定量PCR法单独及联合诊断孕晚期GBS的效能;分析细菌培养法、免疫层析法及实时荧光定量PCR法单独及联合筛查与病理筛查结果的一致性。结果:154例孕晚期孕妇中,经病理活检检出39例孕妇GBS为阳性;三者联合诊断GBS的灵敏度、特异度、准确率、阳性预测值以及阴性预测值均高于细菌培养法、免疫层析法与实时荧光定量PCR法单独检测(P<0.05);三者联合检测与病理结果的Kappa值为0.936,均高于细菌培养法、免疫层析法、实时荧光定量PCR法单独检测。结论:在筛查孕晚期孕妇GBS中,实时荧光定量PCR法联合细菌培养法、免疫层析法诊断效能高于单独检测,可通过三者联合检测为早期诊断孕妇是否感染GBS提供依据。

荧光染色与实时荧光定量PCR法检测在肺结核辅助诊断中的应用效果分析

探究肺结核辅助诊断中最有效的方式。方法 样本选取时间:(2021年1月-2022年6月);样本选取对象:疑似肺结核患者800例;以肺结核基层诊疗指南(实践版·2018)为金标准。分析诊断结果。结果 诊断结果:800例疑似患者中,阳性324例,阴性476例。荧光染色检测:真阳304例、假阳29例、真阴447例、假阴20例;实时荧光定量PCR法:真阳305例、假阳25例、真阴451例、假阴19例;联合:真阳314例、假阳1例、真阴475例、假阴10例。与荧光染色、实时荧光定量PCR法检测相比,联合方式诊断准确性、诊断灵敏性、特异性更高(P<0.05)。结论 荧光染色与实时荧光定量PCR法检测联合诊断肺结核具有较高的诊断效能,可实现早诊断、早治疗,临床应用价值显著,可继续推广及应用。

改良多重实时荧光定量PCR法测定抑癌基因MGMT、p16、CDH13和RASSF1A甲基化在肺癌早期诊断中的作用

目的:建立改良多重实时荧光定量PCR法,检测抑癌基因MGMR、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化,探讨其在肺癌早期诊断中的应用。方法:选取30例病理确诊为肺癌的患者作为肺癌组,30例病理确诊为良性病变的患者作为对照组。建立改良实时荧光定量PCR体系。检测受试者血清MGMT、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化,对比两组基因甲基化阳性率,计算四项基因甲基化单独及联合用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度。结果:肺癌组受试者血清MGMT、p16、CDH13和RASSF1A显著高于对照组(P<0.05);MGMT、p16、CDH13和RASSF1A四项基因甲基化联合检测用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度显著高于单项指标检测(P<0.05)。结论:建立了多重实时荧光定量PCR法用于MGMT、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化检测,联合检测用于肺癌早期诊断具有较高的敏感度和特异度。

实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA测量不确定度评价

目的探讨对实时荧光定量PCR法测HCV-RNA测量不确定度评定的合理方式。方法依据Nordtest准则,利用实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA室内质控及室间质评标本,收集2012年4～9月的HCV-RNA室内质控数据及2010～2012年室间质评结果。计算其批内及批间变异系数、系统偏倚变异系数,确定其相应的标准不确定度分量,进而计算出其扩展不确定度。结果同一天内12次HCV-RNA室内质控的检测批内变异系数为2.55%,2012年4～9月共155个工作日的HCV-RNA检测批间变异系数为5.80%;2010～2012年卫生部临检中心室间质评共30个检测数据的系统偏倚变异系数为5.04%,剔除8个检测为零的数据后重新计算变异系数为5.97%。批内、批间及系统偏倚的因素合成后,扩展不确定度为16.18%,剔除8个检测为零的数据后为17.16%。结论对实时荧光定量PCR法测HCV-RNA测量不确定度的评价,利用现有室内外质控数据,无须额外测试,简单易行,是医学检验实验室较为实用的一种测量不确定度评价方式,但数据的纳入应考虑方法的特殊性。

实时荧光定量PCR法检测外源性DNA在重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中的残留

目的对实时荧光定量PCR(qPCR)法检测重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中的外源性DNA残留量进行探究和分析,确定该方法用于DNA质量控制的可行性。方法采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)提取DNA,利用E.coli残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行扩增反应,绘制标准曲线,建立重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中外源性DNA残留量的qPCR检测方法。结果对8批重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维进行测定,外源性DNA残留量在0.03~300 pg/μl内,重复性良好,均远低于每剂10 ng,线性良好(R^(2)>0.99),回收率均在50%~150%之间。结论该方法可用于重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中外源性DNA残留量的定量测定。

实时荧光定量PCR法在结核性脑膜炎诊断中的应用

结核性脑膜炎（以下简称结脑）是最常见和最严重的肺外结核病之一，由于结核杆菌（TB）的变异和耐药菌的增多，本病的临床表现可不典型，导致诊断难度加大。

实时荧光定量PCR法在儿童巨细胞病毒感染诊断中的应用分析

目的分析实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法在人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)感染诊断中的应用价值。方法选取2021年1月至2023年3月我院收治的88例疑似HCMV感染患儿,于清晨采集患儿空腹静脉血5ml及新鲜晨尿的中段尿5ml,采用ELISA法测定HCMV-IgM,采用FQ-PCR法测定HCMV-DNA。统计病毒培养法诊断结果;以病毒培养法诊断结果作为金标准,计算HCMV-IgM、HCMV-DNA诊断HCMV感染结果,并计算诊断HCMV感染结果与病毒培养法诊断结果的一致性。结果88例疑似HCMV感染患儿中经病毒培养法诊断HCMV感染60例;以病毒培养法诊断结果作为金标准,HCMV-IgM诊断阳性34例,阴性54例,其中漏诊28例,误诊2例,HCMV-IgM诊断结果与病毒培养法诊断结果一致性差(Kappa=0.370,P=0.000);HCMV-DNA诊断阳性52例,阴性36例,其中漏诊9例,误诊1例,HCMV-DNA诊断结果与病毒培养法诊断结果一致性极好(Kappa=0.757,P=0.000);HCMV-DNA诊断灵敏度、准确度均高于HCMV-IgM,差异有统计学意义(P<0.05);HCMV-DNA与HCMV-IgM诊断特异度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论FQ-PCR法诊断HCMV感染灵敏度、准确度及特异度均较高,FQ-PCR法诊断结果与病毒培养法结果一致性较为理想,能够降低误诊、漏诊风险。

实时荧光定量PCR法快速测定水中微囊藻

以铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)16S rRNA基因片段为靶序列设计一对特异性引物,采用Real-time PCR法,对铜绿微囊藻进行定性、定量检测。试验表明,仅含铜绿微囊藻DNA模板的样品有特异性扩增,扩增产物熔解曲线平稳,峰尖且窄,熔解温度为(87±1)℃。以重组质粒pMD-18T-16S为标准品,检测区间为1.1×102copies/mL～1.1×108copies/mL,所得标准曲线符合制备实时定量PCR标准曲线的要求,对标准品进行测定,方法检出限为11 copies/mL。用该标准曲线对实验室培养获得的铜绿微囊藻DNA样品进行定量检测,与显微镜计数结果基本一致。

实时荧光定量PCR法检测淋病奈瑟菌感染的效果

①目的 应用实时荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)技术准确定量检测临床标本中淋病奈瑟菌基因 ,同时与金标准———细菌培养法比较其灵敏度和特异度 ,为临床淋病的诊疗提供依据。②方法 采集 173例病人临床标本 ,以PE5 70 0全自动PCR扩增分析仪和淋病奈瑟菌实时荧光定量PCR检测试剂盒进行核酸检测。同时 ,用含PolyViteX的巧克力板对淋病奈瑟菌进行分离 ,用ATBExpression自动细菌鉴定仪及配套的APINH进行鉴定。③结果 173份临床标本中 ,荧光定量PCR法示 4 7例淋病奈瑟菌阳性 ,阳性率为 2 7.2 % ;细菌培养法示 4 1例淋病奈瑟菌阳性 ,阳性率为 2 3.7%。与细菌培养法相比 ,荧光定量PCR法的灵敏度为 10 0 % ,特异度为 95 .5 % ,两者的符合率为 96 .5 %。④结论 荧光定量PCR技术具有简便、快捷、灵敏度高、特异度高、定量准确等优点 。

实时荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA的价值分析与研究

目的探讨选择实时荧光定量PCR法对乙肝病毒DNA实施检测的临床价值。方法 250例乙型肝炎患者作为此次实验对象,临床选择血清学标志物的方法实施疾病检测后最终有效确诊。对所有乙型肝炎患者临床均选择实时荧光定量PCR法实施疾病检测,对最终检测结果进行分析。结果乙型肝炎患者分别选择荧光PCR法以及血清学标志物方法实施疾病检测,最终获得的检测结果基本表现一致。临床选择实时荧光定量PCR法完成疾病检测后,最终获得的病毒DNA数据更为准确。实时荧光定量PCR法对大三阳临床最终检测阳性率达到了96%;对小三阳,临床最终检测阳性率达到了69%;而对Hbs Ag(-)、乙型肝炎表面抗体(Hbs Ab)(-)以及Hbe Ab(-)以及乙型肝炎E抗原(Hbe Ag)(-)最终检测阳性率只为2.21%。对于大三阳患者以及小三阳患者的血清PCR检测结果进行观察发现,均表现出较高的拷贝数。结论乙型肝炎患者临床选择实时荧光定量PCR法实施疾病检测,针对乙肝病毒以及相关数据完成检测后可以获得准确结果 ,从而证明对乙型肝炎患者在实施疾病检测的过程中,选择实时荧光定量PCR法以及乙肝病毒DNA方法均可以获得较为理想的效果,临床均可以广泛普及应用。

实时荧光定量PCR法在检测3种泌尿生殖道病原微生物中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR法在检测3种泌尿生殖道病原微生物(沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)、淋病奈瑟菌(NG))中的应用。方法 512例门诊和住院疑似泌尿生殖道感染女性患者阴道宫颈分泌物标本,采用实时荧光定量PCR法检测CT、NG、UU,同时用胶体金法检测CT,用培养法进行NG、UU检测。结果 512例疑似泌尿生殖道感染女性患者中,实时荧光定量PCR法和胶体金法检测CT的阳性率分别为10.1%和7.4%。实时荧光定量PCR法和培养法检测UU的阳性率分别为33.4%和23.9%。实时荧光定量PCR法和培养法检测NG的阳性率分别为8.7%和6.1%。阳性检出率为UU>CT>NG,阳性率比较,差异均有统计学意义,实时荧光定量PCR法对CT、NG、UU的检出率高于胶体金法和培养法。结论实时荧光定量PCR法在敏感度、特异度及报告周期上均优于胶体金法和培养法,对STD诊断提供了重要依据,但无法提供药敏报告,可与常规检测方法互相补充。

探讨实时荧光定量PCR法检测血液新生隐球菌的临床意义

目的探讨实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR)法检测新生隐球菌感染的临床应用价值。方法选择2014年2月-2014年7月就诊的47例疑似新生隐球菌感染患者的血液标本,采用常规培养基培养方法以及RT-FQ-PCR法进行检测,计算检测新生隐球菌的阳性率,并进行统计学分析。采用RT-FQ-PCR法对新生隐球菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、黑曲霉、大肠杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌和链球菌这些常见真菌和细菌的DNA进行检测,评价RT-FQ-PCR法的特异性。采用RT-FQ-PCR和常规培养基培养法对稀释至5个/m L的新生隐球菌菌液进行检测,评价RT-FQ-PCR法的灵敏度。结果采用RT-FQ-PCR法,以新生隐球菌特异性引物为探针对新生隐球菌和其他常见真菌及细菌进行检测,只有新生隐球菌出现荧光信号。RTFQ-PCR在5个/m L浓度的新生隐球菌菌液中检测出新生隐球菌,而常规培养基培养法未检测出。在47例疑似新生隐球菌感染患者中,常规培养基培养方法检测出11例,阳性率为23.40%,而RT-FQPCR法检测出14例,阳性率为29.79%,二者经比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 RT-FQ-PCR法与常规培养基培养法对新生隐球菌的检测具有很好的一致性。且RT-FQ-PCR法能够检测出较低浓度的新生隐球菌,较常规培养基培养法快速、灵敏度高、特异性强,可缩短报告时间,为临床早期诊断及治疗新生隐球菌感染提供可靠依据。

实时荧光定量PCR法与涂片法检测结核分枝杆菌的效果对比

目的:对比实时荧光定量P C R法与涂片法检测结核分枝杆菌(MTB)的效果。方法:选取2021年1月—12月滨州市中心医院结核科三病区住院肺结核患者144例,非结核患者41例。所有患者均接受涂片法和实时荧光定量PCR法进行结核分枝杆菌检测,观察两种检测方式的诊断效果。结果:实时荧光定量PCR法阳性率(60.00%)高于涂片检测法(42.16%),差异有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量PCR法诊断灵敏度、特异度、准确度及阴性预测值均高于涂片法,差异有统计学意义(P<0.05);两种检测方法诊断阳性预测值比较,差异无统计学差异(P>0.05)。结论:实时荧光定量PCR法优于涂片法,能够提高MTB检测的阳性率和诊断准确率,为患者后续治疗提供有利的诊断依据,值得临床应用。

实时荧光定量PCR法与杂交捕获法在高危型HPV检测中的比较

大量研究已经证明，人乳头瘤病毒感染（HPV），特别是高危型人乳头瘤病毒感染，在妇女宫颈疾病的发生和发展中起着重要的作用。HPV感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变（CIN）的主要病因，高危型HPV感染是宫颈癌及其癌前病变的必要条件。据报道…，宫颈癌患者HPV阳性率可达到99．7％，HPV感染使宫颈癌的相对危险陛增加200多倍，是可能罹患宫颈癌的信号，故可利用HPVDNA检测宫颈早期病变，对病变的治疗及预防有具有重要意义。

实时荧光定量PCR法检测环境假单胞菌属细菌丰度

应用实时荧光定量PCR法，建立了总细菌及假单胞菌属的标准曲线，并以环境样本中假单胞菌属与总细菌的比值反映其细菌丰度．应用该方法评价人工除藻反应器中组合填料、无纺布、弹性填料等介质对太湖水中溶藻细菌之一的假单胞菌属的富集情况．结果显示：该方法对总细菌的检测范围为10^3～10^8个基因拷贝/μL（R^2=0．997）；假单胞菌属的检测范围为1～10^5个基因拷贝／μL（R^2=0．994）．对除藻反应器溶藻细菌富集效果的评价显示，所建立的方法能有效检测反应器中填料对该类溶藻细菌的富集程度．初步证明所建立的方法可有效定量假单胞菌属在环境样本中的丰度．

利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究

转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素,因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键.利用高通量、快速、灵敏的SYBR GreenⅠ荧光定量实时PCR法,检测了转大麦烟酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷贝数.以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为水稻的内源参照基因,通过梯度稀释法,分别获得了NAS1和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线,相关系数分别为0.99976和0.99571,相关性高.通过目的基因NAS1和水稻内源参照基因SPS起始模板数的比较,获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数,在8株转基因株系中,1株为假阳性,1株拷贝数为1,3株拷贝数为2,其余3株拷贝数分别为3、4和7,而阴性对照拷贝数为0.这种方法快速、简便、准确,可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择.

实时荧光定量PCR法检测治疗后龈下菌斑中优势菌的变化

目的:运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测慢性牙周炎患者治疗前、后龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Pg)和中间普氏菌(Pi)的拷贝数,以了解qRT-PCR对2种牙周致病菌检测的敏感性和牙周治疗的疗效。方法:选取62例中、重度牙周炎患者,分别采用龈下刮治、牙周袋内盐酸米诺环素软膏(派丽奥)给药和两者综合治疗,采集治疗前、后(7d)龈下菌斑,提取细菌基因组DNA,合成针对Pg和Pi的16S rRNA基因的特异引物,运用qRT-PCR法检测Pg和Pi的拷贝数。采用SAS 9.1.3软件包对数据进行Kruskal-Wallis和Wilcoxon秩和检验。结果:Pg、Pi在不同样品组中检测到的绝对拷贝数数量分别为103～106和102～106,在慢性牙周炎患者龈下菌斑中的检出率和绝对拷贝数量显著高于健康对照组(P<0.05);3组治疗后的Pg数量比治疗前下降,其中综合治疗组和派丽奥治疗组下降率显著高于龈下刮治组。Pi的数量在派丽奥治疗组和龈下刮治组治疗后无显著减少,但在综合治疗组显著下降(P<0.05)。结论:qRT-PCR法能快速鉴定和精确定量Pg和Pi;综合治疗法比单一疗法能更有效抑制Pg和Pi。

实时荧光定量PCR法检测草莓镶脉病毒

为了建立一种特异、灵敏、快速检测草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据已有的检测SVBV的引物信息,合成引物,对不同草莓品种进行PCR扩增。经过克隆、测序及序列比对得到了感染SVBV的阳性植株,利用此植株PCR扩增产物构建重组质粒作为标准品,优化了PCR反应体系,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系(R2=0.999 1);进行了灵敏度和重复性试验,敏感性可达到10~1拷贝·μL^(-1),约为普通PCR的1 000倍,重复性好;并与常规PCR方法进行了比较,成功建立了检测SVBV的实时荧光定量PCR法。用该方法检测了部分草莓品种的DNA样品,结果表明,大部分植株都带有SVBV。该方法具有很高的灵敏性和重复性,可用来快速检测草莓植株是否感染SVBV。

实时荧光定量PCR法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad2/3mRNA表达的影响

目的:检测葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad 2/3mRNA表达的影响,从分子生物学层面探讨葛根素治疗骨质疏松症的机理。方法:取小鼠胎鼠成骨细胞进行体外培养,以三种浓度1、0.1、0.01μg/mL的葛根素液进行干预,同时设置空白对照组,分别采用碱性磷酸酶(ALP)法检测成骨细胞活性,实时荧光定量PCR法检测葛根素干预液对成骨细胞TGF-β1及Smad 2/3mRNA表达变化的影响。结果:不同浓度葛根素干预液均能够增加成骨细胞内碱性磷酸酶的活性,并且呈浓度依赖性,实时荧光定量PCR结果显示成骨细胞内TGF-β1及Smad 2/3mRNA的表达明显高于阴性对照组(具有统计学差异P<0.05)。结论:表明葛根素可刺激成骨细胞信号转导蛋白Smad2/3mRNA的表达和刺激TGF-β1的分泌和合成,从而促进骨形成,抑制骨吸收。可能是其有效防治骨质疏松症的疗效机理。