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基于实时荧光环介导等温扩增技术同时检测副溶血弧菌与金黄色葡萄球菌 被引量:6
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作者 刘丹 谢加玲 +3 位作者 张孟雨 陈松 李孜 钟青萍 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第22期255-262,共8页
分别针对副溶血弧菌及金黄色葡萄球菌的特异性基因bla_(CARB-17)、nuc设计引物,通过优化反应条件,建立一种能够同时检测副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的实时荧光环介导等温扩增(real-time loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP... 分别针对副溶血弧菌及金黄色葡萄球菌的特异性基因bla_(CARB-17)、nuc设计引物,通过优化反应条件,建立一种能够同时检测副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的实时荧光环介导等温扩增(real-time loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)的检测方法,对其特异性、灵敏度和适用性进行了研究。结果表明该方法特异性好、灵敏度高,对副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的检出限分别为3.62×10^(2)、1.45×10^(4) copies/mL,灵敏度是普通PCR方法的10倍。实现了一次LAMP反应中同时检测2种食源性致病菌,既缩短检测时间,也提高了检测效率,为多重LAMP检测食源性致病菌的研究提供参考。 展开更多
关键词 食源性致病菌 副溶血弧菌 金黄色葡萄球菌 实时荧光环介导等温扩增技术 快速检测
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实时荧光环介导等温扩增技术检测乳粉中的肺炎克雷伯氏菌 被引量:14
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作者 陈文秀 姜旋 +1 位作者 马晓燕 张伟 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第20期192-197,共6页
为了建立食品中肺炎克雷伯氏菌灵敏快速的检测方法,根据GenBank中已公布的肺炎克雷伯氏菌phoE基因设计引物,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测食品中肺炎克雷伯氏... 为了建立食品中肺炎克雷伯氏菌灵敏快速的检测方法,根据GenBank中已公布的肺炎克雷伯氏菌phoE基因设计引物,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测食品中肺炎克雷伯氏菌的方法,可直观判定检测结果,仪器亦可自动显示检测结果。对该检测方法的特异性、灵敏度等方面进行研究,并与聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法进行比较。结果表明,实时荧光LAMP检测方法特异性强、灵敏度高。用于特异性实验的21株实验菌株中,4株肺炎克雷伯氏菌,呈现阳性结果,而其他17株非肺炎克雷伯氏菌,均呈阴性结果;检测纯菌的灵敏度和检测人工污染乳粉的检出限分别为79 CFU/mL和79 CFU/g,是常规PCR检测方法的100倍。总之,本研究建立的实时荧光LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、耗时短、结果判定直观,实现了对肺炎克雷伯氏菌的快速检测。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯氏菌 phoE基因 实时荧光介导等温 检测 SYBR GreenⅠ
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实时荧光环介导等温扩增技术检测土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌 被引量:3
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作者 李子微 宾蕾 +6 位作者 尹艳 高琦 赵勇 张平平 潘纹玉 陆沙 邓仲良 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期216-222,共7页
目的结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性。方法根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环... 目的结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性。方法根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp),优化反应条件,扩增产物经电泳鉴定。通过类鼻疽伯克霍尔德菌和其他致病菌验证特异性,比较RealAmp与普通LAMP技术的敏感度,并测定人工污染土壤模拟样本的检出限。结果恒温63℃条件下,20~60 min即可完成RealAmp检测;利用该方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌为阳性,其余致病菌如鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、大肠杆菌等13株参考菌株及蜱虫的DNA(含大量假单胞菌属细菌)呈扩增阴性;RealAmp技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌核酸的灵敏度为10~2 CFU/mL,检测克隆株质粒的灵敏度可达10~1 copies/μL,比普通LAMP技术的灵敏度高10倍;人工污染土壤模拟样本RealAmp的检出限为4.4×10~1 CFU/g,且20 min左右即可判定结果;直接检测24份浓度为4.4×10~1 CFU/g~4.4×10~8 CFU/g的类鼻疽伯克霍尔德菌人工污染土壤样本,在检出限以上,检出率同荧光定量PCR一致。结论该方法特异性强、灵敏度高,且可实时监测类鼻疽伯克霍尔德菌,有望成为快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的有效方法,增强抵御生物恐怖战争的能力。 展开更多
关键词 类鼻疽伯克霍尔德菌 filc基因 快速检测 介导等温技术
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实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌 被引量:24
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作者 贾雅菁 付博宇 +4 位作者 王羽 马晓燕 张先舟 苑宁 张伟 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第6期184-189,共6页
建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法,根据已公布的蜡样芽孢杆菌hbl A基因序列设计内外引物,并向反应体系中加入荧光染料SYBRGreenⅠ,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated i... 建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法,根据已公布的蜡样芽孢杆菌hbl A基因序列设计内外引物,并向反应体系中加入荧光染料SYBRGreenⅠ,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,Real Amp)检测蜡样芽孢杆菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定。通过21株致病菌验证RealAmp特异性,并比较了Real Amp与普通环介导等温扩增技术的敏感性,对人工污染的检出限进行了测定。结果表明对21 株致病菌进行特异性实验,4株蜡样芽胞杆菌呈阳性结果,17株非蜡样芽胞杆菌均呈阴性结果。RealAmp检测纯菌的灵敏度为8.2 CFU/m L,比普通环介导等温扩增技术的灵敏度高10倍,人工污染牛乳RealAmp的检出限为8.2 CFU/m L。并且在20 min左右即可判定结果。该方法快速、准确、灵敏度高、操作便捷、可实时监控检测蜡样芽孢杆菌,有望成为快速检测蜡样芽孢杆菌的有效方法。 展开更多
关键词 实时荧光介导等温检测技术 蜡样芽胞杆菌 检测 牛乳
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实时荧光环介导等温扩增技术检测猪肉中的假单胞菌 被引量:3
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作者 李宁 张友雄 +5 位作者 吴清平 古其会 张银志 王加生 孙秀兰 张菊梅 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2019年第6期264-272,共9页
根据假单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,并向反应体系中加入饱和型核酸染料Eva Green,利用实时荧光检测仪,建立假单胞菌属实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)。研究中对62株假单胞菌的16SrDNA基因通过DNAMAN软件进行序列比对后,针对共有... 根据假单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,并向反应体系中加入饱和型核酸染料Eva Green,利用实时荧光检测仪,建立假单胞菌属实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)。研究中对62株假单胞菌的16SrDNA基因通过DNAMAN软件进行序列比对后,针对共有片段设计扩增引物。对扩增体系进行了优化,优化结果经电泳鉴定。通过12株假单胞菌和23株非假单胞菌进行特异性验证,并比较了实时荧光LAMP与普通LAMP的灵敏度,对人工污染样品的检出限进行了测定。结果表明,特异性验证中12株假单胞菌为阳性,23株非假单胞菌为阴性。实时荧光LAMP检测纯菌的灵敏度为36 CFU/mL,是普通LAMP灵敏度的10倍。人工污染样品的检出限为1.73×10^3 CFU/g。本研究中建立了一种检测冷鲜猪肉中假单胞菌属的方法,实现了多个菌种的同时检测,避免了单一菌种检测的局限性,该方法快速、准确、灵敏度高,可在2h内完成冷鲜猪肉中假单胞菌的检测。 展开更多
关键词 实时荧光介导等温 假单胞菌 检测 猪肉
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实时荧光环介导等温扩增技术检测婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的研究 被引量:5
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作者 石伟雄 王羽 +1 位作者 杨粤 张伟 《食品安全质量检测学报》 CAS 2016年第6期2263-2272,共10页
目的建立实时荧光环介导等温扩增法(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测阪崎克罗诺杆菌。方法以阪崎克罗诺杆菌(基因号AY702093)16S^23S rRNA的保守序列进行引物设计,对dNTPs、Mg^(2+)及模板... 目的建立实时荧光环介导等温扩增法(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测阪崎克罗诺杆菌。方法以阪崎克罗诺杆菌(基因号AY702093)16S^23S rRNA的保守序列进行引物设计,对dNTPs、Mg^(2+)及模板浓度等反应条件进行优化,并考察该方法的特异性和灵敏度。结果实时荧光LAMP法检测的最佳反应体系为:内引物1.6μL FIP和1.6μL BIP,外引物:0.5μL F3和0.5μL B3,2.5μL2.5mmol/L d NTP,2μL 4 mmol/L MgSO_4,3μL Buffer,1.6μL 10×Bst DNA聚合酶,3μL DNA模板,0.5μL 100×荧光染料,用灭菌双蒸水补足25μL体系,在63℃下反应60 min。除阪崎克罗诺杆菌之外其他菌株均没有产生特异性荧光扩增曲线。实时荧光LAMP检测克罗诺杆菌的灵敏度可达到8×10-2 CFU/mL。结论本方法检测克罗诺杆菌具有耗时短、特异性强及灵敏度高等优点,可为快速检测婴儿配方奶粉中的克罗诺杆菌提供参考。 展开更多
关键词 实时荧光 介导等温 阪崎克罗诺杆菌 婴儿配方奶粉
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实时荧光环介导等温扩增技术快速检测牛肉中的大肠杆菌O157 被引量:2
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作者 苑宁 石磊 +5 位作者 王永 陈发荣 时凡 徐慧 贾丽娜 张伟 《食品安全质量检测学报》 CAS 2018年第24期6489-6495,共7页
目的建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RF-LAMP)快速检测大肠杆菌(Escherichia coli,EHEC)O157的分析斱法。方法针对大肠杆菌O157编码O抗原的rfbE基因设计引物。对该斱... 目的建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RF-LAMP)快速检测大肠杆菌(Escherichia coli,EHEC)O157的分析斱法。方法针对大肠杆菌O157编码O抗原的rfbE基因设计引物。对该斱法迚行特异性验证,同时对大肠杆菌O157:H7纯培养物的灵敏度和人工污染牛肉的检出限迚行测定,对61份牛肉样品迚行RF-LAMP检测,幵与GB4789.36-2016斱法迚行比较,评价RF-LAMP斱法的敏感性、特异性和准确度。结果 10株大肠杆菌O157呈阳性结果, 21株非大肠杆菌O157呈阴性结果,该斱法特异性良好。纯培养物检测的灵敏度为5.1CFU/mL,人工污染的牛肉样品的检出限为5.1 CFU/g。结论本研究建立的RF-LAMP技术特异性好、灵敏度高、操作简单,可实时监测扩增反应,避克了繁琐的电泳过程,实现了对大肠杆菌O157的快速检测,对大肠杆菌O157引起的食源性疾病的预防和控制具有重要意义。 展开更多
关键词 实时荧光 介导等温 大肠杆菌O157 rfbE基因 牛肉 快速检测
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实时荧光环介导等温扩增快速分型致泻大肠埃希氏菌方法的建立
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作者 李芮 黄艳梅 +5 位作者 童晓钰 山珊 刘成伟 谭俣宬 陈芳 刘道峰 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期233-240,I0005,I0006,共10页
致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一种重要的食源性致病菌,该研究立足DEC目前流行率高、基层分型困难的现状,建立了快速分型5种DEC的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法... 致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一种重要的食源性致病菌,该研究立足DEC目前流行率高、基层分型困难的现状,建立了快速分型5种DEC的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对DEC的8段特征性毒力基因pic、aggR、lt、st、stx 1、stx2、escV、invE及大肠埃希氏菌属特异性基因uidA设计LAMP引物,优化反应体系,并对方法的分析性能及临床菌株分型效果进行了评价。结果显示,所建立的方法对pic和escV的检出限是1 ng/μL,对aggR、stx 1、invE和uidA的检出限是100 pg/μL,对lt、st和stx 2的检出限是10 pg/μL,该方法灵敏度与特异度均为100%,DEC型别间无交叉反应,对临床菌株的分型与实际结果完全一致。方法快速简便、设备要求低,借助恒温荧光读取设备可在40 min内迅速判定待检菌株是否为DEC及其致病类型,可满足各机构现场快速检测的需求。 展开更多
关键词 致泻大肠埃希氏菌 实时荧光介导等温 快速检测 毒力基因 分型 食品安全
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环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用
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作者 廖川 梁丽娜 +3 位作者 黄少宇 马梦霞 李雪斌(综述) 韦贵将(审校) 《检验医学与临床》 CAS 2024年第7期1003-1007,1024,共6页
病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染... 病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断。基于这种情况,该文主要阐述了LAMP的原理、特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展。LAMP技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性、引物设计复杂等不足之处。该文综述了近年来LAMP技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向。 展开更多
关键词 介导等温技术 核酸检测 病原微生物 核酸 结核分枝杆菌
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基于可视化和实时荧光环介导等温扩增技术快速鉴定日本红菇
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作者 赵兰馨 赵晓燕 +4 位作者 易思亮 田恩静 范婷婷 赵志勇 周昌艳 《中国食品卫生杂志》 CSCD 北大核心 2023年第10期1440-1447,共8页
目的利用可视化和实时荧光环介导等温扩增(LAMP)技术,建立日本红菇的快速鉴别方法。方法基于日本红菇内转录间隔区的基因序列设计了特异性的LAMP引物,在23种蘑菇物种间进行特异性验证,通过检测10 ng/μL~1 fg/μL系列浓度的基因组DNA,... 目的利用可视化和实时荧光环介导等温扩增(LAMP)技术,建立日本红菇的快速鉴别方法。方法基于日本红菇内转录间隔区的基因序列设计了特异性的LAMP引物,在23种蘑菇物种间进行特异性验证,通过检测10 ng/μL~1 fg/μL系列浓度的基因组DNA,评估方法的灵敏度。结果设计的LAMP引物可特异性鉴别日本红菇,不与其他蘑菇种类发生交叉反应。建立的LAMP方法检测灵敏度为1%混合蘑菇样本,或终浓度为2 pg/μL的日本红菇DNA。结论本方法可用于新鲜/干制蘑菇及烹饪后蘑菇的检测,检测时间<1 h,其中可视化方法无需专业仪器设备,适用于日本红菇的现场快速鉴别。 展开更多
关键词 日本红菇 可视化介导等温 实时荧光介导等温 快速鉴定 蘑菇及其制品
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环介导等温扩增技术在农业病害检测中的应用综述
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作者 王一波 孙泓希 +5 位作者 史普想 孙继军 韩宁 任亮 张丽丽 王海新 《江苏农业科学》 北大核心 2024年第7期17-24,共8页
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸等温扩增技术,其原理是当温度为60~65℃时,DNA处于动态平衡状态,DNA双链打开,此时依赖Bst DNA聚合酶的链置换活性,使DNA可以在60~65℃的恒温下进行合成... 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸等温扩增技术,其原理是当温度为60~65℃时,DNA处于动态平衡状态,DNA双链打开,此时依赖Bst DNA聚合酶的链置换活性,使DNA可以在60~65℃的恒温下进行合成。其扩增引物是基于靶基因的6个特异性区域设计的,扩增阶段需要引物与样品DNA完全结合,才可以进行扩增,所以LAMP技术具有高特异性与高灵敏性。其反应温度恒定,不需要额外的控温设备,理想条件下仅需保温杯,即可进行DNA扩增。在田间检测时,只需提取样品总DNA,即可于田间进行病害检测,缩短了检测流程及时间,使病害检测更高效更便捷。在反应前或反应后加入特定染色剂,即可通过染色剂的变色情况进行反应结果的判定,使反应结果可视化。目前该技术已凭借其特异性高、灵敏性高、所用仪器简单(恒温水浴锅或保温杯即可)、检测效率高和检测结果可视化等优点,广泛应用于临床病原微生物检测、食品微生物检测、环境微生物检测、植物或微生物基因鉴定等领域。在农业病害的病原微生物(真菌、细菌、病毒、线虫)快速检测和诊断领域,已有很多研究针对各种病害建立了相应的LAMP检测技术。本文简要综述了LAMP技术原理、反应结果判定、优缺点和该技术目前在农业常见病原物检测中的应用,并对LAMP技术的应用前景进行了进一步的展望。 展开更多
关键词 介导等温技术 农业病害 检测 应用
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环介导等温扩增技术结合乳胶微球试纸条检测副溶血性弧菌
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作者 贾博涵 张琳 +3 位作者 陈耀 黄小桃 谭有将 关烨锋 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第1期74-84,共11页
目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的方法。方法以副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH... 目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的方法。方法以副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH)基因作靶标设计引物,6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-FAM)和生物素(Biotin)标记引物,对体系各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量LAMP(quantitative LAMP,qLAMP)反应,比较三者的敏感度;对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、粪链(肠)球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP-LMTS的可靠性。结果LAMP-LMTS方法的灵敏度可达4.16×10^(2)copies/μL,与qLAMP、LAMP-琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)方法结果一致,检出限要比利用外引物建立的PCR方法低10倍的拷贝数,灵敏度更高。结论该方法检测副溶血性弧菌具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于基层实验室、应急检测或现场监测,具有较高的推广价值。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 乳胶微球试纸条 介导等温技术 快速检测
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实时荧光环介导等温扩增技术检测熏肉中单增李斯特氏菌的研究 被引量:2
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作者 李森 贾丽娜 +5 位作者 王鑫 杨倩 马晓燕 魏丹 袁耀武 张伟 《食品科技》 CAS 北大核心 2018年第8期319-324,共6页
建立一种实时荧光环介导等温扩增方法(Real-Time Fluorescence Loop-mediated Isothermal Amplification,RTF-LAMP)来快速、灵敏地检测熏肉中单增李斯特氏菌。针对单增李斯特氏菌的特异性基因inl B设计4条LAMP引物,并建立一套最优的RTF-... 建立一种实时荧光环介导等温扩增方法(Real-Time Fluorescence Loop-mediated Isothermal Amplification,RTF-LAMP)来快速、灵敏地检测熏肉中单增李斯特氏菌。针对单增李斯特氏菌的特异性基因inl B设计4条LAMP引物,并建立一套最优的RTF-LAMP反应体系。对该方法进行特异性验证,同时对灵敏度和人工污染熏肉的检出限进行测定。3株单增李斯特氏菌被检测为阳性,17株非单增李斯特氏菌为阴性。表明引物具有良好的特异性。RTF-LAMP和传统LAMP检测单增李斯特氏菌的灵敏度分别为1.1×10~1、1.1×10~2 CFU/m L。通过对熏肉进行人工污染,得出RTF-LAMP的检出限为3.5×10~1 CFU/g。通过与国标方法GB 4789.30—2016进行对比并计算RTF-LAMP反应的敏感性,特异性和准确度,结果分别为100.00%、98.44%和98.46%。研究建立的RTF-LAMP能够实时、快速地检测熏肉中单增李斯特氏菌,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 实时荧光介导等温 李斯特氏菌 inlB 检测 熏肉
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实时监控新孢子虫环介导等温扩增方法的建立及初步应用
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作者 王雅华 王准 +4 位作者 刘博 肖芳 龚贺 王伟利 王向辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期592-597,共6页
为建立一种快速检测新孢子虫的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据GenBank中登录的新孢子虫Nc-5基因序列(X84238.1)设计2对特异性引物,通过PCR扩增将新孢子虫Nc-5基因片段并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒pMD18-T-Nc-5,并经PCR和... 为建立一种快速检测新孢子虫的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据GenBank中登录的新孢子虫Nc-5基因序列(X84238.1)设计2对特异性引物,通过PCR扩增将新孢子虫Nc-5基因片段并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒pMD18-T-Nc-5,并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。通过优化该方法的引物浓度、反应温度,并利用LAMP浊度仪测定扩增目的基因时出现白色焦磷酸镁的浊度值实时监控反应进程,初步建立了检测新孢子虫的LAMP方法,反应结束后通过加入SYBR Green I观察荧光对结果可视化判定。反应条件优化结果显示,引物F3/B3和FIP/BIP的终浓度分别为10 pmol/μL、20 pmol/μL,63℃扩增40 min效率最佳。利用该方法检测新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫、环形泰勒虫、双芽巴贝斯虫、伊氏锥虫核酸,并在反应结束后加入SYBR Green I观察荧光以评估该方法的特异性。结果显示仅新孢子虫核酸扩增为阳性,其余病原核酸均为阴性结果。荧光观察结果显示,新孢子虫反应管呈翠绿色荧光(阳性),其他反应管呈橙黄色荧光(阴性);对重组质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板(即4.0×10^(7)拷贝/μL~4.0×100拷贝/μL)进行LAMP的敏感性试验,结果显示该方法对质粒标准品的检测限为4.0×10^(1)拷贝/μL,且在反应结束后加入SYBR Green I,4.0×10^(7)拷贝/μL~4.0×10^(1)拷贝/μL质粒标准品的反应管均呈翠绿色荧光(阳性),4.0×100拷贝/μL反应管呈橙黄色荧光(阴性),敏感性与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499)中荧光定量PCR方法的敏感性一致;分别以同一时间和不同时间提取的3个不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。综上表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。对895份临床疑似感染新孢子虫的动物肝脏、脑组织样品同时采用建立的LAMP方法及《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499)中的荧光定量PCR方法检测,结果显示LAMP的阳性检测率为41.45%(371/895),阴性率为58.55%(524/895),与SN/T 3499中的荧光定量PCR检测结果一致。本研究建立的新孢子虫LAMP方法快速、敏感、特异性强,且能够实时监测反应过程并能可视化判定结果,为新孢子虫现场快速检测提供了新的技术手段。 展开更多
关键词 新孢子虫 介导等温技术 检测
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等温扩增技术在水产品寄生虫检测中的应用研究进展
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作者 孙晓红 张妮 +3 位作者 赵嘉怡 李达容 赵勇 蓝蔚青 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期383-388,共6页
水产品中寄生虫可引起食源性疾病,已成为影响食品安全的重要因素之一。近年来,基于传统分子生物学发展而来的等温扩增技术以其恒温、高效、耗时短、不过度依赖设备和仪器等优点,逐渐应用于分子诊断和疾病检测。该文在介绍等温扩增技术... 水产品中寄生虫可引起食源性疾病,已成为影响食品安全的重要因素之一。近年来,基于传统分子生物学发展而来的等温扩增技术以其恒温、高效、耗时短、不过度依赖设备和仪器等优点,逐渐应用于分子诊断和疾病检测。该文在介绍等温扩增技术原理与特点的基础上,综述了其在水产品中寄生虫检测方面的应用研究进展,提出存在问题与解决办法,并展望了等温扩增技术的应用前景,以期为快检技术在水产品质量安全控制技术中的研究开发提供理论参考。 展开更多
关键词 水产品 寄生虫 介导等温技术 重组酶聚合酶等温技术
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猴免疫缺陷病毒实时荧光环介导等温扩增快速检测方法的建立
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作者 刘助红 王静 +4 位作者 黄碧洪 尹雪琴 张钰 郭鹏举 黄韧 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2017年第5期37-41,共5页
以猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)的核心蛋白Gag区域的部分保守基因序列为检测靶标,通过软件设计内、外引物和环引物,借助恒温荧光扩增仪建立SIV实时荧光环介导等温扩增快速检测方法(real-time loop-mediated isoth... 以猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)的核心蛋白Gag区域的部分保守基因序列为检测靶标,通过软件设计内、外引物和环引物,借助恒温荧光扩增仪建立SIV实时荧光环介导等温扩增快速检测方法(real-time loop-mediated isothermal amplification,Realamp),根据有无"S"型扩增曲线判断检测结果。Realamp方法对含有猴免疫缺陷病毒目标片段的质粒标准品的检测灵敏度为300 copies/μL,对猴类的其他常见病原如猴D型逆转录病毒、猴T淋巴细胞趋向性病毒、猴B病毒等无非特异性扩增。通过33份临床样本的检测,Realamp检出的阳性2例,qPCR检出的阳性率为1例,两种检测方法的符合率为97%。本研究建立的Realamp检测技术所需设备简单、反应效率快、检测灵敏度高和特异性强,可用于偏远地区猴养殖单位相关病原的检测。 展开更多
关键词 猴免疫缺陷病毒 实时荧光环介导等温扩增技术 检测
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基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌 被引量:1
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作者 邹作成 王西 +9 位作者 刘雪兰 胡仲皓 田祥强 何晓花 杜晓莉 王佳玲 李柯 刘浩洋 嵇辛勤 胡青海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第5期108-113,共6页
金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因... 金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方15法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10^(1) CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10^(5) CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 nuc基因 介导等温核酸技术 可视化
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改良的环介导等温扩增技术在羊布鲁菌病快速诊断中的应用
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作者 于广江 张可欣 +2 位作者 郭文平 刘金霞 郭亚春 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第5期101-107,共7页
布鲁菌病严重威胁人类健康和畜牧业生产的常见人畜共患病。建立改良的LAMP,对防控布鲁菌病的传播具有重要意义。选择羊布鲁菌标准菌株DNA保守序列,设计LAMP引物;建立并优化LAMP快速检测体系;通过倍比稀释法等完成灵敏度和特异性实验;选... 布鲁菌病严重威胁人类健康和畜牧业生产的常见人畜共患病。建立改良的LAMP,对防控布鲁菌病的传播具有重要意义。选择羊布鲁菌标准菌株DNA保守序列,设计LAMP引物;建立并优化LAMP快速检测体系;通过倍比稀释法等完成灵敏度和特异性实验;选择可疑布鲁菌感染羊血液样本200例,分别进行LAMP、PCR和RBPT检测,完成一致性检验。LAMP反应体系中MgSO_(4)为8 mmol/L,甜菜碱为0.8 mmol/L,钙黄绿素为5 mmol/L,MnCl_(2)为10 mmol/L;布鲁菌均呈现绿色,5种阴性菌株均为橙色;随着模板稀释度的逐渐增大,扩增开始时间逐渐延长,检测极限为10 copies/μL,与凝胶电泳、PCR结果一致;与PCR比较,羊血液标本LAMP阳性率基本一致,无统计学意义(P>0.05);与RBPT比较,LAMP阳性率显著升高,有统计学意义(P<0.05);PCR和LAMP检测一致性较好(Kappa=0.987,P>0.7)。因此,本研究为布鲁菌病提供了特异性好,灵敏度高检测试剂盒。 展开更多
关键词 羊布鲁菌病 介导等温技术 特异性诊断 诊断试剂盒
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实时荧光环介导等温扩增技术检测糕点中沙门氏菌的研究 被引量:3
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作者 于潇潇 张蕴哲 +2 位作者 徐慧 张伟 苑宁 《食品科技》 CAS 北大核心 2019年第4期333-337,共5页
研究建立一种实时荧光环介导等温扩增技术(Real-time?uorescence loop-mediated isothermal amplification,RF﹣LAMP)检测沙门氏菌的方法。利用invA基因设计引物,进行特异性验证,并对灵敏度和人工污染蛋糕的检出限进行测定。结果显示,... 研究建立一种实时荧光环介导等温扩增技术(Real-time?uorescence loop-mediated isothermal amplification,RF﹣LAMP)检测沙门氏菌的方法。利用invA基因设计引物,进行特异性验证,并对灵敏度和人工污染蛋糕的检出限进行测定。结果显示,沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,表明特异性良好。该方法检测纯培养物的灵敏度为6.3 cfu/mL,人工污染蛋糕样品的检出限为63 cfu/g。另外,利用该方法对65份糕点样品进行检测,并与GB 4789.4—2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、98.44%和98.46%。该方法特异性好,灵敏度高,操作简单,可实时监测扩增反应,对沙门氏菌引起的食源性疾病的预防和控制具有重要意义。 展开更多
关键词 实时荧光 介导等温 沙门氏菌 INV A基因 糕点
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环介导等温扩增技术可视化快速检测表皮葡萄球菌方法的建立
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作者 李冉 薛晶 +2 位作者 郭文平 康精萌 刘金霞 《承德医学院学报》 2023年第6期456-460,共5页
目的建立可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,应用于表皮葡萄球菌的快速检测。方法针对表皮葡萄球菌的Ses B基因,选择特异性引物,建立环介导等温扩增体系。对反应的可视化方法、体系中的Mg SO4浓度、甜菜碱浓度、反应温度、反应时间进... 目的建立可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,应用于表皮葡萄球菌的快速检测。方法针对表皮葡萄球菌的Ses B基因,选择特异性引物,建立环介导等温扩增体系。对反应的可视化方法、体系中的Mg SO4浓度、甜菜碱浓度、反应温度、反应时间进行优化。将优化好的LAMP反应和PCR反应的灵敏度和特异性进行比较。结果环介导等温扩增反应体系中最适MgSO4终浓度为4mM;最适甜菜碱浓度为0.4M;最适反应温度和时间为63℃,反应60 min;最适宜的可视化方法为钙黄绿素显色法且可视化结果与琼脂糖凝胶电泳结果基本一致;LAMP和PCR反应均具有较好的特异性,LAMP反应的灵敏度为10 copies/μL,PCR反应的灵敏度为100 copiesμL。结论LAMP钙黄绿素可视化检测表皮葡萄球菌感染优于普通PCR,操作简便且不需要昂贵检测设备,有望应用于基层和偏远贫困地区早期诊断。 展开更多
关键词 介导等温技术 表皮葡萄球菌 Ses B基因 可视化 快速检测
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