实时荧光等温多自配引发扩增技术检测深圳市手足口病肠道病毒71型评价

目的：应用实时荧光等温多自配引发扩增技术（荧光RT-IMSA）实现肠道病毒71型（EV71）快速检测．为手足口病的综合防治和动态监测提供手段和依据。方法：随机选取2014年1-12月深圳市哨点医院手足口病确诊患者轻症156例，重症84例，运用荧光RT-IMSA技术检测患者样本EV71，描述EV71的流行病学特征，并与qRT-PCR法比较。结果：240例手足口病确诊患者中，重症患者EV71检出率为77．3％，轻症患者25．6％（P〈O．05）。男女性EV71感染率相同（P〉0．05），年龄为0～1岁患者EV71感染率较低（P〈0．05）。荧光RT-IMSA技术与qRT-PCR法比较结果较一致，rappa值为0．87（P〈0．05）。结论：深圳市EV71在不同年龄、不同病情的手足口病患者中分布不同。荧光RT-IMSA法呈现较高的特异性和灵敏度，可用于EV71的快速检测。

基于实时荧光环介导等温扩增技术同时检测副溶血弧菌与金黄色葡萄球菌

分别针对副溶血弧菌及金黄色葡萄球菌的特异性基因bla_(CARB-17)、nuc设计引物,通过优化反应条件,建立一种能够同时检测副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的实时荧光环介导等温扩增(real-time loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)的检测方法,对其特异性、灵敏度和适用性进行了研究。结果表明该方法特异性好、灵敏度高,对副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的检出限分别为3.62×10^(2)、1.45×10^(4) copies/mL,灵敏度是普通PCR方法的10倍。实现了一次LAMP反应中同时检测2种食源性致病菌,既缩短检测时间,也提高了检测效率,为多重LAMP检测食源性致病菌的研究提供参考。

实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌

建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法,根据已公布的蜡样芽孢杆菌hbl A基因序列设计内外引物,并向反应体系中加入荧光染料SYBRGreenⅠ,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,Real Amp)检测蜡样芽孢杆菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定。通过21株致病菌验证RealAmp特异性,并比较了Real Amp与普通环介导等温扩增技术的敏感性,对人工污染的检出限进行了测定。结果表明对21 株致病菌进行特异性实验,4株蜡样芽胞杆菌呈阳性结果,17株非蜡样芽胞杆菌均呈阴性结果。RealAmp检测纯菌的灵敏度为8.2 CFU/m L,比普通环介导等温扩增技术的灵敏度高10倍,人工污染牛乳RealAmp的检出限为8.2 CFU/m L。并且在20 min左右即可判定结果。该方法快速、准确、灵敏度高、操作便捷、可实时监控检测蜡样芽孢杆菌,有望成为快速检测蜡样芽孢杆菌的有效方法。

实时荧光跨越式滚环等温扩增技术检测食品中的志贺氏菌

该研究建立一种实时荧光跨越式滚环等温扩增(real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification,RFSRCA)技术快速检测志贺氏菌(Shigella)。该方法以志贺氏菌的ipaH基因设计引物,使用32株不同菌株对RF-SRCA方法的特异性进行分析,根据实时荧光曲线法对RF-SRCA方法的灵敏度和检出限进行判定,并使用该方法对60份食品样品进行检测。结果表明:13株志贺氏菌菌株呈阳性结果,19株非志贺氏菌菌株呈阴性结果,说明该方法特异性良好;RF-SRCA的灵敏度为5.97×10^(0)fg/μL,比普通SRCA方法高10倍;其在人工污染牛奶样品中的检出限为8.6×10^(0)CFU/mL,比普通SRCA方法检出限低10倍;60份食品样品中阳性样品数为2份,其检出率与SRCA方法一致,为3.33%。综上,RF-SRCA方法在检测志贺氏菌方面操作简单,特异性强,灵敏度高,能够实现快速检测。

人乳头瘤病毒16和52型双荧光等温多自配引发扩增的检测方法

应用等温多自配引发扩增(IMSA)技术,分别针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的E7和52型的E6基因序列设计6条特异性引物,并在检测体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)和SYBR GreenⅠ的混合双荧光指示剂,建立快速检测人乳头瘤病毒的双荧光IMSA方法.结果表明:340μmol/L HNB与1∶10 000SYBR GreenⅠ混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果,455nm蓝光激发下阳性反应管双荧光显色为黄绿色,阴性反应管双荧光显色为橘红色;该方法对HPV16和HPV52型检测限分别达60,600拷贝/μL,可特异性检出样品中HPV16和HPV52,与临床检测结果比对无差异.

利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术及环介导等温扩增技术在结核性脑膜炎的诊断价值

目的评价脑脊液利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpert MTB/RIF)及脑脊液环介导等温扩增技术(LAMP)在结核性脑膜炎中的诊断价值。方法收集临床诊断为结核性脑膜炎住院患者110例,随机收集60例为结核性脑膜炎A组,50例为结核性脑膜炎B组,另收集其他中枢神经系统感染患者脑脊液20例为对照组(CG组)。其中结核性脑膜炎A组患者入院后抽取脑脊液送脑脊液常规、生化、结核菌涂片、结核菌培养、GeneXpert MTB/RIF,结核性脑膜炎B组患者送脑脊液作常规、生化、结核菌涂片、结核菌培养和LAMP,CG组患者送脑脊液作常规、生化、结核菌涂片、结核菌培养、GeneXpert MTB/RIF和LAMP。结果结核性脑膜炎A组脑脊液GeneXpert MTB/RIF阳性32例,其中利福平耐药基因检测阳性3例,结核性脑膜炎A组脑脊液结核菌涂片、培养、GeneXpert MTB/RIF阳性率分别为8.3%(5/60)、16.7%(10/60)和53.0%(32/60)。结核性脑膜炎B组50例脑脊液结核菌涂片、结核菌培养、LAMP,阳性率分别为8.0%(4/50),18.0%(9/50)和58.0%(29/50),CG组脑脊液GeneXpert MTB/RIF和脑脊液LAMP均为阴性。结论脑脊液GeneXpert MTB/RIF及脑脊液LAMP均为早期诊断结核性脑膜炎的较好方法。

等温多自配引发扩增技术快速检测学校餐饮中三种食源性致病菌

目的:本文研究了一种适合学校餐饮中快速鉴别三种食源性致病菌的检测方法。方法:基于等温多自配引发扩增技术(isothermal multiple self-matching-initiated amplification,IMSA),选择沙门氏菌的invA基因、大肠埃希氏菌O157:H7/NM的rfbE基因和单核细胞增生李斯特氏菌的prfA基因设计特异性引物,检测菌液灵敏度、特异性、最短增菌时间、最低含菌量检出限等指标;以食品安全国家标准食品微生物学检验(GB/T 4789.4-2016、GB/T 4789.30-2016、GB/T 4789.36-2016)为参考方法,比较两种方法的一致性。结果:该方法对沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7/NM和单核细胞增生李斯特氏菌的菌液灵敏度分别为2.14×10^(3)、2.79×10^(3)和3.62×10^(3)CFU/mL;特异性高达100%;人工污染最短的增菌时间分别为6、8和8 h;最低含菌量检出限分别为2.14、2.79和3.62 CFU/25 g;74例食品样本的IMSA法结果与国标法一致性达100%。结论:IMSA技术检测食源性致病菌的灵敏度高、特异性强、结果准确,可在短时间内完成食品中三种致病菌的检测,适合于学校餐饮中致病菌的快速鉴别。

猴免疫缺陷病毒实时荧光环介导等温扩增快速检测方法的建立

以猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)的核心蛋白Gag区域的部分保守基因序列为检测靶标,通过软件设计内、外引物和环引物,借助恒温荧光扩增仪建立SIV实时荧光环介导等温扩增快速检测方法(real-time loop-mediated isothermal amplification,Realamp),根据有无"S"型扩增曲线判断检测结果。Realamp方法对含有猴免疫缺陷病毒目标片段的质粒标准品的检测灵敏度为300 copies/μL,对猴类的其他常见病原如猴D型逆转录病毒、猴T淋巴细胞趋向性病毒、猴B病毒等无非特异性扩增。通过33份临床样本的检测,Realamp检出的阳性2例,qPCR检出的阳性率为1例,两种检测方法的符合率为97%。本研究建立的Realamp检测技术所需设备简单、反应效率快、检测灵敏度高和特异性强,可用于偏远地区猴养殖单位相关病原的检测。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10^(3) copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。

环介导等温扩增技术在现场工作中的应用进展

核酸扩增技术是病原微生物检测和遗传性疾病诊断的重要武器，其中常规PCR和实时荧光定量PCR已在临床检验中得到广泛的应用，但这些技术操作复杂，对实验室人员、仪器和环境的要求较高。无法在基层和现场工作中灵活使用。环介导等温扩增（100p—mediatedisothermalamplification．LAMP）是日本学者Notomi等于2000年发明的核酸扩增技术。与PCR技术相比，具有操作简单快速、对仪器和样本质量要求低等特点．尤其适用于现场工作使用。

环介导等温扩增技术快速检测呼吸道博卡病毒

目的:建立一种检测呼吸道博卡病毒的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法:通过博卡病毒NP1基因特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,建立LAMP检测体系。并对60例疑感染者的咽试子,同时采用实时荧光定量PCR和LAMP方法进行博卡病毒核酸的检测。结果:通过凝胶电泳能观察到LAMP方法扩增引物的存在,且采用此体系的检测60份咽试子中8份阳性反应和实时荧光定量PCR检测结果一致。结论:博卡病毒核酸的LAMP检测方法快速、简单、特异、灵敏、成本低,对实验仪器设备要求不高,适用于基层医疗机构临床检测和现场快速诊断。

环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒方法的建立

将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合建立一种快速检测草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的LAMP-LFD检测方法,并与实时荧光定量PCR(qPCR)技术进行对比。以GCRV S8片段为检测靶标,设计6条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3,LF/LB),其中上游引物FIP以生物素(Biotin,BIO)标记,进行LAMP反应条件优化,同时设计1条羟基荧光素(Fluorescein amidite,FAM)标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间40min。从LAMP扩增到LFD结果判读共需50min,比qPCR检测缩短近1h。LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出GCRV,针对同一重组质粒的检测,LAMP-LFD的检测限为970fg,qPCR的检测限为97fg,虽然LAMP-LFD的检测灵敏度低于qPCR 10倍,但该方法操作简单,仪器设备依赖性低,可快速、特异地检测出GCRV,有望成为GCRV现场快速检测的常规技术手段。

ERA实时荧光法快速检测乙肝病毒的建立与应用

基于酶促重组等温扩增(ERA)技术构建一种快速检测乙肝病毒的实时荧光检测方法。根据乙肝病毒聚合酶编码区(P区)保守序列设计引物和探针,对引物、温度、荧光探针浓度等反应条件进行优化,建立ERA实时荧光法最佳反应体系,再对其敏感性、特异性、抗干扰能力、临床样本检出效果进行验证。结果显示:ERA实时荧光法在42℃、20 min内可完成对乙肝病毒的检测,最低检出限为102 copies/μL;除乙肝病毒外,其他4种病毒(甲肝病毒、丙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒)均未产生荧光扩增曲线,具有良好的特异性和抗干扰能力;以实时荧光PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法检测58份乙肝病毒临床样本的灵敏度为97.37%、特异度为100%、阴性预测值为95.24%、阳性预测值为100%、Kappa值为0.96。成功建立了一种简单、快速、灵敏、特异、低成本的乙肝病毒早期检测方法,满足乙肝病毒快速检测的需要。

实时荧光技术在鸭坦布苏病毒RT-LAMP检测方法中的应用

由鸭坦布苏病毒(DTMUV)引起的蛋鸭产蛋急剧下降给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。针对DTMUV E基因保守区域设计一套LAMP引物,利用实时荧光技术建立了DTMUV的实时RT-LAMP病原检测方法。该方法检测RNA的最低检测极限可达到7.8 copies,其灵敏度是普通RT-PCR的100倍,且只能特异性扩增DTMUV的RNA,对其他常见鸭源病毒核酸均无特异性扩增。该方法简单快速、特异性强和灵敏度高,判定结果只需要观察扩增曲线,适用于DTMUV早期感染的诊断、分子流行病学调查和疫情监测。

环介导等温扩增与qPCR用于检测肉制品中狗源性成分的比较

目的建立基于实时荧光PCR和环介导等温扩增检测肉制品中狗源性成分的检测方法并比较2种方法的检测效能。方法针对狗线粒体CYTB基因保守序列,采用Primer Explorer Version 4软件设计环介导等温扩增引物,Primer Express 3.0.1软件设计实时荧光PCR引物及探针。提取狗肉基因组DNA作为阳性模板,黄牛肉等20种基因组DNA作为阴性对照,分析扩增特异性;用含靶序列的人工质粒确定检测灵敏度及人工掺肉样确定最低检出限;用市售肉制品分析检出率。结果对于肉制品中狗源性成分检测,实时荧光PCR和环介导等温扩增检测均有较好的特异性,人工质粒分析灵敏度分别为0.1、1fg/μL。对10种市售狗肉制品的狗源性成分均检出阳性、10份不含狗肉制品均检出阴性,qPCR法和环介导等温扩增法的检测结果符合率均为100%。结论qPCR法和环介导等温扩增法在检测肉及肉制品中的狗源性成分时,在灵敏度、检出限和准确度上具有相当的效能。

4种实验室检测技术对肺外结核病成人患者非呼吸道标本中结核分枝杆菌检出率对比观察

目的 对比观察结核菌荧光染色、环介导等温扩增技术(LAMP)、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)、全自动分枝杆菌液体培养检测技术(BACTEC MGIT 960)诊断成人肺外结核病非呼吸道标本结核分枝杆菌(MTB)的效能。方法 收集2019年1月—2021年12月确诊为肺外结核病患者的非呼吸道标本317例份(组织155例份、尿液52例份、胸水47例份、脓液41例份、脑脊液22例份),分别采用荧光染色、LAMP、BACTEC MGIT 960、Xpert MTB/RIF检测,比较各检测技术检测同一种非呼吸道标本的MTB检出率。结果 LAMP、Xpert MTB/RIF、BACTEC MGIT 960、荧光染色的MTB检出率分别为72.6%、70.3%、48.3%、22.7%。在组织标本中的MTB检出率差异具有统计学意义(P<0.05),表现为LAMP和Xpert MTB/RIF检出率最高,其次为BACTEC MGIT960,荧光染色检出率最低;在尿液标本中的MTB检出率差异具有统计学意义(P均<0.05),表现为LAMP和Xpert MTB/RIF检出率最高,其次为BACTEC MGIT 960和荧光染色;在胸水标本中的MTB检出率差异具有统计学意义(P均<0.05),表现为LAMP和Xpert MTB/RIF检出率较高,其次为BACTEC MGIT 960,荧光染色最低;在脓液标本中的MTB检出率差异具有统计学意义(P均<0.05),表现为LAMP和Xpert MTB/RIF检出率较高,其次为BACTEC MGIT960,荧光染色最低;在脑脊液标本中的MTB检出率差异具有统计学意义(P均<0.05),表现为LAMP、Xpert MTB/RIF和BACTEC MGIT 960检出率较高,荧光染色最低。245例荧光染色阴性的标本中,LAMP、BACTEC MGIT 960和Xpert MTB/RIF的MTB检出率分别为66.1%、39.2%和63.7%,LAMP和Xpert MTB/RIF在涂阴标本中的检出率差异无统计学意义,但均高于BACTEC MGIT 960(P均<0.05)。126例标本为Xpert MTB/RIF和BACTEC MGIT 960同时阳性,两种方法检测利福平耐药性统计分析发现,Kappa值为0.829,P<0.05。结论 LAMP和Xpert MTB/RIF诊断人肺外结核病非呼吸道标本MTB灵敏度和特异度高,同时具有检测速度快的优势;荧光染色特异度高,但灵敏度低;BACTEC MGIT 960和Xpert MTB/RIF对利福平药敏的一致性强,但培养时间长,后续能得到药物种类多,对临床治疗在药物选择性上高。

斑点叉尾鮰病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)属于大DNA病毒,是一种能引起斑点叉尾鮰(Letalurus punetaus)病毒性疾病的重要病原。研究以编码产物为磷酸激酶的CCV ORF77基因为靶标,设计了能识别靶基因上的8个独立区域的6条特异引物,利用基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了用于CCV的实时荧光LAMP快速检测方法。结果显示,建立的实时荧光LAMP检测方法在63℃恒温反应45min条件下,反应大约12min后出现明显的峰值,最低检测限度为100个拷贝的病毒质粒DNA,检出时间为35min;并且具有良好的特异性,与白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)等常见水生动物病原DNA均没有交叉反应;同一样品于试验内及试验间重复性试验发现,20个平行样品的扩增曲线基本重合,表现出良好的重复性。通过对实际样品的检测结果显示,实时荧光LAMP检测方法能够特异性的检出CCV。因此,研究建立的CCV实时荧光LAMP检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠,能为斑点叉尾鮰养殖现场和实验室的斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原的快速诊断和实时监测方面提供技术支撑。

鸭坦布苏病毒快速实时荧光RT-LAMP方法的建立及初步应用

为建立检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)的荧光逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法,根据DTMUV NS5基因保守序列设计1套特异性引物,对反应时间和温度进行优化,并评价该方法的特异性、敏感性、重复性和临床适用性。结果显示:建立的荧光RT-LAMP最优反应条件为65℃25 min;只特异性扩增DTMUV,而不扩增其他几种禽类病毒;最低检测限为4×10^(2)copies/μL,与qRT-PCR方法敏感性一致,是普通RT-PCR的100倍;批内和批间重复性高;应用该方法检测DTMUV不同剂量人工感染鸭肝脏样品,对接毒剂量为10^(3-7)TCID_(50)和10^(2-7)TCID_(50)组的阳性检出率均为100%,对接毒量10^(1.7)TCID_(50)组的阳性检出率为90%(9/10)。结果表明,本研究建立的荧光RT-LAMP检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可成为快速诊断DTMUV的方法之一。

埃博拉病毒扎伊尔亚型多引物自配引发等温扩增方法的建立

鉴于目前埃博拉疫情在西非流行和输入国内的潜在风险,开发快速准确易普及的检测埃博拉病毒的方法对埃博拉防控具有重大意义。本文拟建立一种基于颜色判定简单、快速和灵敏的方法,即多引物自配引发等温扩增技术(isothermal multiple self-matching initiated amplification,IMSA)应用于埃博拉病毒扎伊尔亚型的检测。该技术设计了分别对应于埃博拉病毒扎伊尔型核蛋白(nuclear protein,NP)基因的7个区段的6条特异引物,在等温(63℃)条件下进行核酸扩增反应1小时,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色变化作为结果判定的标准。文中利用这种技术与RT-qPCR分别对含有目的片段的假病毒的系列稀释物以及模拟临床样本进行灵敏度分析,同时对30例健康人血浆以及登革病毒、日本脑炎病毒样本进行特异性分析。在塞拉利昂完成了81例埃博拉疑似病例血液样本的检测。结果显示RT-IMSA方法检测灵敏度与RT-qPCR方法的灵敏度相当,30例健康人血浆样本检测均为阴性,并且与登革病毒及日本脑炎病毒无交叉反应。与获得批准的荧光定量PCR试剂盒比较,RT-IMSA检测81例临床样本的结果为53例阳性,23例阴性,5例假阴性。灵敏度和特异性分别为91.4%和100%。因此,相较于RT-qPCR的高成本和复杂操作,RT-IMSA方法具有快速、简单的检测优势。

基于分子生物学技术检测食物过敏原的研究进展

食物过敏现象越来越普遍,已经严重影响了部分人群的生活质量甚至危及生命,国际上有关食物过敏事件的报道屡见不鲜。如何快速、准确、高通量、低成本地检测食物中的过敏原成分,已成为监管部门和食品企业的关注焦点。本文综述了以酶联免疫吸附法、PCR法、实时荧光定量PCR法、环介导等温扩增技术及生物芯片技术为主的几种分子生物学检测技术检测食物过敏原的方法,并对这几种方法的准确性、重复性等进行比较,探讨了食品中过敏原检测方法的发展前景。与传统过敏原检测方法相比,现行生物芯片技术具有高通量、对单一样品同时检测多种过敏原成分的特点,将成为一种新颖有效的过敏原检测工具。